Tesis Doctorals - Departament - Físicoquímica

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Estudios fisicoquímicos de las construcciones tetraméricas de las secuencias peptídicas (11-25) de la proteína VP1 y (110-121) de la proteína VP3 del virus de la hepatitis A con modelos de membrana
(Universitat de Barcelona, 2002-01-01) Ortiz Rodrigo, Alba; Alsina Esteller, Ma. Asunción; Cajal Visa, Yolanda; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] a hepatitis A es una enfermedad infecciosa aguda extendida a nivel mundial, y que a pesar de no ser grave, conlleva unos elevados gastos sanitarios y afecta anualmente a 1.4 millones de personas. Puesto que las vacunas existentes, basadas en vírus inactivados, son muy caras, existe un elevado interés en el desarrollo de vacunas igualmente efectivas y seguras, pero de coste suficientemente bajo para hacerlas accesibles a los países subdesarrollados, donde la enfermedad se encuentra más extendida. Por otra parte, la mayoría de péptidos y proteínas con actividad biológica, incluyendo los antígenos peptfdicos, adquieren su conformación bioactiva al interaccionar con la membrana celular, concretamente con el entorno anfipático de la bicapa lipídica. Por ello, el estudio de la interacción péptido lípido utilizando modelos sintéticos de membrana es de gran interés para determinar las bases estructurales que definen la actividad biológica. Teniendo en cuenta estos antecedente_s, en esta tesis se pretende establecer las bases para el desarrollo de una vacuna sintética contra el virus de la hepatitis A basada en péptidos sintéticos. Los objetivos específicos son los siguientes: 1. Sintetizar antígenos peptídicos múltiples. (MAPs) basados en varias copias de una misma secuencia peptídica correspondiente a una proteína del virus de la hepatitis A. Se seleccionaransecuencias antigénicas de las proteínas VP1 y VP3 del cápside del virus, y se prepararán construcciones de cuatro de estas secuencias unidas por un núcleo ramificado de resíduos de lisina. De esta manera, se persigue incrementar la capacidad antigénica de las secuencias peptídicas sin necesidad de administrarlas conjuntamente con proteínas u otras sustancias inmunoadyuvantes. 2. Estudiar la interacción de estos antígenos peptidicos múltiples con modelos sintéticos de membrana: monocapas en la interfase agua/aire y vesículas lipídicas unilarninares. A diferencia de las membranas biológicas, que presentan gran complejidad, los modelos sintéticos propuestos presentan importantes ventajas, como su simplicidad y la posibilidad de controlar variables como1a compos ición, la curvatura, la presión lateral, etc., aspectos todos ellos de gran relevancia en la interacción de epítopos peptídicos con las membranas celulares. Se prepararán modelos de membrana de tres composiciones, con carga neta positiva, negativa o zwitterionica, a fin de elucidar los componentes electrostático e hidrofóbico en la interacción lípido-péptido. 2.1. La miscibilidad de los componentes lipídicos de los modelos de membrana seleccionados se determinará mediante la técnica de la balanza de Langmuir. 2.2. Monocapas extendidas en la interfase agua/aire: mediante la técnica de la balanza de Langp1uir, nos proponemos caracterizar la interacción de los MAPs sintetizados realizando estudios de penetración en la interfase a diferentes presiones superficiales, así como isotermas de compresión de monocapas mixtas péptido/lípido. 2.3. Vesículas lipídicas unilaminares (liposomas): se aplicará una batería de técnicas espectroscópicas para determinar la interacción de los MAPs con liposomas de las mismas composiciones empleadas en la preparación de las monocapas. Concretamente, se realizarán estudios de fluorescencia intrínseca y extrlnseca, de transferencia de energía por resonancia y de polarización de fluorescencia para determinar la unión de los péptidos a las membranas así como los posibles cambios en las propiedades fisicoquímicas de las mismas. La información obtenida podría aplicarse también al disefio de una vaclma sintética donde los MAPs se administrasen incorporados en liposomas, de manera que los epítopos adoptasen la conformación activa que facilitase su reconocimiento por las células del sistema inmune.
Estudio teórico del transporte de ligandos en proteínas y de la afinidad ligando-receptor
(Universitat de Barcelona, 2007-01-01) Bidon-Chanal Badia, Axel; Luque Garriga, F. Xavier; Orozco López, Modesto; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La eficacia de un ligando en su interacción con una macromolécula biológica depende no solo de su capacidad para interaccionar de forma complementaria y específica con la constelación de grupos químicos presentes en el centro de unión, sino también de su difusión a través de la matriz proteica para alcanzar dicho centro. Aunque difusión y unión reflejan el balance de fuerzas intermoleculares establecido entre ligando y receptor, los determinantes moleculares que subyacen pueden ser diferentes. lo que plantea un reto en su descripción mediante modelización. Con el objetivo general de identificar los determinantes moleculares asociadas a difusión y unión de ligandos en dos sistemas de relevancia biológica planteamos el análisis de dos sistemas. Por un lado, Ia acetilcolinesterasa, donde nos interesó Ia identificación de los factores que determinan la afinidad entre ligando y receptor. Por otro lado, la hemoglobina truncada N de M. tuberculosis, donde nos interesó estudiar el mecanismo molecular asociado a la difusión de ligandos a través de la matriz proteica. En cuanto al enzima acetilcolinesterasa, los objetivos específicos del presente trabajo consisten en Ia identificación de los determinantes moleculares que modulan la afinidad de tres tipos de inhibidores duales: A.l) deri vados tacrina-ftalimida, A.2) derivados tacrina-indol y A.3) deri vados tacrina-donepezilo. Todos ellos tienen como motivo común el anillo de tacrina (o cloro-tacrina), cuya presencia debería permitir la unión al centro catalítico del enzima, mientras que las estructuras consideradas difieren en la unidad química destinada a interaccionar con el centro periférico. Con respecto a la hemoglobina trucada N de M. tuberculosis, los objetivos especificos que se han planteado en este trabajo son: B. l) identificar el mecanismo molecular de migración de ligandos diatómicos (O2 y NO) hacia el centro activo, prestando especial atención a las características estructurales de las dos ramas del túnel observado en la matriz proteica, y su implicación funcional en la migración de ligandos, y B.2) establecer el mecanismo de liberación del anión nitrato, cuya salida a través del túnel observado en la estructura de rayos X no puede explicarse de forma convincente teniendo presente tanto su carga neta como su tamaño, por lo cual cabe especular con la posibilidad de que exista una ruta de eliminación altemativa no observada en la estructura cristalográfica.
Diseño y síntesis de nanosistemas derivatizados con péptidos y su aplicación en biomedicina
(Universitat de Barcelona, 2015-12-18) Vasconcelos Pacheco, Aimee; Haro Villar, Isabel; García López, María Luisa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La introducción de la nanomedicina en el ámbito de la farmacología ha revolucionado la administración de fármacos, con la aparición de nuevos tratamientos con mayor especificidad, aumentando el rendimiento biológico y farmacológico, ofreciendo así alternativas interesantes para formular nuevas moléculas. El presente trabajo tiene como finalidad el diseño de NPs poliméricas y liposomas para su aplicación en la “Terapia Ocular” y el “Diseño de inhibidores del HIV-1”. En la primera parte de este estudio se desarrollaron formulaciones que contienen Flurbiprofeno, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), que se utiliza en la cirugía de cataratas. Para ello se siguieron dos estrategias de preparación distintas: 1) NPs derivatizadas en la superficie con PEG y péptidos, abreviadas como PLGA-NPs-PEG-Péptido, 2) y la síntesis de copolímeros PLGA-PEG-Péptido con posterior preparación de las NPs, abreviadas como PLGA-PEG-Péptido-NPs. De todas las formulaciones desarrolladas, las PLGA-PEG-Péptido-NPs, en específico las PLGA-PEG-POD-NPs, han presentado los mejores resultados, obteniéndose una estrecha distribución de tamaño de partícula, una alta eficiencia de encapsulación del Flurbiprofeno y una liberación más sostenida. Asimismo, su morfología esférica se pudo comprobar mediante las técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica. Estas presentaron un tamaño de partícula apropiado, y mejoraron la biodisponibilidad y el tiempo de residencia del Flurbiprofeno en el saco conjuntival. Su menor tamaño de partícula fue un aspecto importante que condujo a una óptima tolerancia ocular y una mayor respuesta antiinflamatoria. En la segunda parte de este proyecto se estudiaron péptidos derivados de las proteínas de envoltura (E1 y E2) del virus GBV-C. Con aras de aumentar la capacidad anti-HIV-1 del péptido P6-2 (perteneciente a la proteína E2) se realizaron diferentes modificaciones químicas de su estructura: incorporación de un ácido graso en el extremo amino terminal (Pal-P6-2), obtención de NPs poliméricas del tipo PLGA-PEG-NPs-P6-2 y liposomas con diferentes composiciones, del tipo LUV, que contienen los péptidos P6-2 y la molécula quimérica resultante de la unión de este último péptido y el péptido VIR, previamente reportado por su capacidad anti-HIV-1 (VIR-P6-2). Paralelamente se han obtenido nanopartículas de PLGA derivatizadas con el péptido de fusión del HIV-1 (NPs PLGA-PF-HIV-1). Este esfuerzo atendió al creciente interés del estudio de interacción de péptidos provenientes de la proteína E1 del GBV-C. El péptido E1P8 cíclico es un fragmento de la proteína E1 del GBV-C que ha mostrado tener una elevada capacidad inhibitoria. La técnica de Diferencia de la Transferencia de Saturación (RMN-STD) ha mostrado una gran utilidad para llevar a cabo estudio de interacción receptor-ligando. Este estudio nos permitió afirmar que existe una interacción entre el péptido E1P8 cíclico y las NPs PLGA-PF-HIV-1, obteniéndose mayor intensidad en las señales de STD. La intensidad de la señales se traduce como una escala de proximidad de las distintas zonas de la estructura peptídica (E1P8 cíclico) a las NPs PLGA-PF-HIV-1, manifestando que existe interacción a nivel atómico.
Desarrollo y caracterización de liposomas para aplicación tópica de fármacos
(Universitat de Barcelona, 2015-12-21) Vázquez González, Martha Leticia; Borrell Hernández, Jordi; Calpena Campmany, Ana Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La piel es el órgano más extenso y accesible del cuerpo, debido a ello la administración de fármacos por vía tópica para efectos locales o sistémicos ha sido ampliamente documentada. A pesar de todas las ventajas que la administración tópica de fármacos ofrece, la piel y su compleja estructura formada de múltiples capas, la cual le proporciona excelentes propiedades de barrera, hacen que la administración de medicamentos a través de esta vía sea un proceso complicado. En las últimas décadas, con la finalidad de evadir la extraordinaria función de barrera del estrato córneo, se han empleado diversas estructuras nanoscópicas que han aumentado el espectro de fármacos susceptibles de ser administrados por vía tópica. Estos hechos alientan la investigación en el desarrollo de formulaciones para mejorar la administración tópica de fármacos. En la presente investigación, diseñamos formulaciones de liposomas para la administración tópica de fármacos, teniendo como hipótesis que la adición extemporánea de un activador de membrana en los liposomas, desestabiliza parcialmente las vesículas para que al contacto con la superficie de la piel humana promueva la liberación del principio activo y con ello aumente su biodisponibilidad. Se estudiaron dos fármacos, el ibuprofeno y el ácido hialurónico (AH), y la eficacia de las formulaciones fue evaluada mediante ensayos in vitro y ex vivo con piel humana. Posteriormente, para tener un conocimiento más profundo acerca de cómo las formulaciones desarrolladas aumentan la liberación de los fármacos, se utilizó el microscopio de fuerza atómica (AFM) y se observaron las estructuras que forman las formulaciones desarrolladas al ser aplicadas en la superficie de la piel humana. Inicialmente, se utilizó fosfatidilcolina (PC) para producir los liposomas y en una segunda etapa de la investigación, se diseñó una composición biomimética con los principales componentes del estrato córneo. En base a esta composición se siguió la estrategia de incorporar los fármacos previamente estudiados, en combinación con los surfactantes seleccionados. La eficacia de las formulaciones fue evaluada y se verificó que la adición de potenciadores de la permeación (PEs) a liposomas, mejora la permeación de AH e ibuprofeno a través de la piel humana. En relación a las imágenes obtenidas mediante el AFM, se observó que la adición de PEs promueve claramente la formación de las estructuras planas, debido a las regiones, parecidas a bicapas o multicapas de lípidos, en coexistencia con liposomas no fusionados y/o intactos observadas. Se estudiaron también las modificaciones de las propiedades elásticas que se producen en las formulaciones desarrolladas al ser aplicadas, lo que permitió correlacionar estas propiedades con la permeación del fármaco incorporado en los liposomas. Por lo tanto, la técnica empleada en el desarrollo del presente trabajo de investigación puede utilizarse como herramienta auxiliar en el desarrollo de sistemas nano vesiculares para administración transdérmica de fármacos.
Theoretical study of ligand migration in Hemeproteins: Truncated Hemoglobin N and Nitrophorin 7
(Universitat de Barcelona, 2013-11-18) Novo de Oliveira, Ana Luísa; Luque Garriga, F. Xavier; Bidon-Chanal Badia, Axel; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El proyecto a desarrollar se centrará en los aspectos dinámicos del transporte de ligandos en hemoproteínas, centrándose en dos tipos principales. Por un lado la hemoglobina truncada N de Mycobacterium tuberculosis, y por otro nitroforina. La hemoglobina truncada N desempeña un papel muy importante como mecanismo de defensa del microorganismo, pues transforma el óxido nítrico (NO) generado por los macrófagos durante las etapas iniciales de respuesta a la infección en anión nitrato. Ello, pues, permite la subsistencia del microorganismo, que permanece en estado de latencia, dificultando la recuperación del paciente de tuberculosis. En consecuencia, dicha proteína aparece como una diana de potencial valor terapéutico, puesto que su inactivación debería reducir significativamente la resistencia del microorganismo. Los estudios del Prof. Luque han perseguido dilucidar los aspectos moleculares que subyacen en la capacidad de la proteína de captar O2 y NO, y de llevar a cabo la reacción química de conversión a nitrato. En particular, se ha propuesto un mecanismo de transporte de ligandos, y el objetivo que se plantea es su validación mediante el examen de diversos mutantes obtenidos al modificar el residuo que controla la migración a través del canal. En cuanto a nitroforina, es una hemoproteína transportadora de NO que se halla en la saliva de insectos cuya alimentación se basa en sangre. Uno de ellos, Rhodnius prolixus, está implicado en la enfermedad de Chagas, que causa un número elevado de muertes (aproximadamente 15000 por año). De entre los diversos tipos de nitroforinas, nuestro interés se centra en nitroforina 7 (NP7), que difiere en el extremo N-terminal respecto a otras nitroforinas. El objetivo del trabajo se centra en determinar el efecto de dichas diferencias sobre la capacidad de captación y transporte de NO. En ambos casos, los proyectos se llevan a cabo en colaboración con grupos experimentales, y confiamos que dicha colaboración permita abrir estrategias de intervención terapéutica.
Exploració computacional de compostos bioactius: reactivitat i interacció lligand-receptor
(Universitat de Barcelona, 2015-07-09) Llabrés Prat, Salomé; Luque Garriga, F. Xavier; Pouplana Solé, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] La present tesis doctoral, presentada com a compendi de publicacions, té com a objectiu general l’estudi de la diversitat en l’espai químic i l’establiment de relacions amb l’espai biològic mitjançant l’ús de tècniques computacionals. Per aconseguir aquest objectiu es van definir dues línies de recerca: l’estudi de noves reaccions multicomponent, i l’estudi de la interacció lligand-receptor per una diana poc comuna i la seva aplicació per al desenvolupament de fàrmacs antigripals. El capítol dedicat a la reactivitat inclou dues publicacions (Preciado S. et al. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51, pp 6874–6877; Llabrés S. et al. Chemistry, a European Journal, 2013, 40, pp 13355– 13361) on es racionalitza el mecanisme d’una nova reacció multicomponent anomenada Mannich Ritter Amidina (MRA). Aquesta es va descobrir mitjançant un canvi d’un reactiu de la reacció multicomponent de Povarov, que va resultar en un producte tetracíclic. Aquest nou producte té una estereoquímica inesperada ja que la unió de dos anells es produeix en syn. Es va dur a terme l’exploració química d’aquesta reacció, la qual va concloure que aquesta reacció MRA només funcionava si s’usaven alguns alquens activats determinats, com ara tipus dihidropirà i ciclohexadiè, i en canvi no en alquens tipus enamides cícliques. A més, quan s’utilitza el ciclohexadiè, la reacció MRA dóna lloc a dues reaccions que entren en competició. L’estudi computacional de explica com la conformació de l’estat de transició és un factor clau en l’estereoselectivitat de la reacció MRA. L’habilitat de deformar la conformació cadira i de bot de l’anell que té caràcter de doble enllaç explica els diferents rendiments de la reacció. El capítol dedicat al disseny d’inhibidors del canal M2 del virus de la grip A inclou dues publicacions (Rey-Carrizo M. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, pp 5738–5747; Rey-Carrizo M. et al. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 96, pp 318–329) i un manuscrit (en preparació) centrats en el desenvolupament de nous compostos inhibidors del canal M2 nadiu i de la seva variant V27A. Els fàrmacs que inhibeixen aquest canal són amantadina i rimantadina, però la FDA no recomana el seu ús perquè l’aparició de soques mutants ha reduït molt la seva eficàcia. El risc d’una possible pandèmia i l’aparició de soques resistents ha promogut un esforç continuat en la recerca de nous fàrmacs antigripals. En col·laboració interdisciplinar entre diversos grups de disseny, síntesi i avaluació farmacològica, en aquest capítol s’ha estudiat el mecanisme d’acció de fàrmacs inhibidors del canal M2 nadiu i del canal mutant V27A, una mutació generada per l’ús dels fàrmacs. El treball computacional s’ha centrat en l’elucidació dels modes d’unió d’aquests compostos en ambdós canals i en les relacions estructura-activitat mitjançant tècniques de dinàmica molecular i càlculs de mecànica quàntica. Per últim, també s’ha explorat el mecanisme d’unió al lloc d’unió del canal mitjançant dinàmica molecular i tècniques de mostreig exhaustiu, com ara la metadinàmica. Aquests estudis han permès identificar dos llocs d’unió en el porus del canal, i caracteritzar el mecanisme d’unió, que afecta la rotació de l’inhibidor a l’interior del canal. Tanmateix, han permès explicar la dràstica disminució d’activitat d’amantadina pel canal mutat V27A.
Asociación de pranoprofeno a sistemas nanoestructurados para administración tópica
(Universitat de Barcelona, 2015-04-10) Abrego Escobar, Guadalupe; García López, María Luisa; Calpena Campmany, Ana Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En el presente trabajo, pranoprofeno (PF) fue asociado a nanopartículas (NPs) poliméricas de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA), preparadas por la técnica de desplazamiento del disolvente. Las PF-NPs fueron optimizadas usando un diseño factorial. Las formulaciones optimizadas fueron aquellas que se prepararon con un pH de la fase acuosa de 4.5 ó 5.5; una concentración de PF de 1.0 ó 1.50 mg/mL; tensoactivo 5 ó 10 mg/mL y PLGA 9.0 ó 9.5 mg/mL. En estas condiciones experimentales, las PF-NPs optimizadas (PF-F1NPs y PF-F2NPs) mostraron un tamaño de partícula apropiado para la administración ocular y/o dérmica (alrededor de 350 nm) y una alta eficiencia de encapsulación del fármaco en el polimero (80%). Para asegurar la estabilidad de las PF-NPs durante un largo período de almacenamiento las formulaciones optimizadas fueron sometidas a un proceso de liofilización. Las características fisicoquímicas de las PF-NPs antes y después de liofilizar fueron similares entre sí. Las interacciones fármaco – polímero fueron evaluadas a través de difracción de rayos X, mediciones espectrales FTIR y análisis de DSC. Los resultados obtenidos sugieren la ausencia de interacciones químicas y confirman que el fármaco se dispersó en el interior de la matriz polimérica. Las PF-NPs optimizadas fueron incorporadas en un hidrogel de Carbómero (HG_PF-F1NPs y HG_PF-F2NPs) o hydrogel en presencia de un 1% ó 3% de azona (HG_PF-F1NPs-Azona y HG_PF-F2NPs-Azona), con la finalidad de obtener formulaciones semisólidas que permitan prologar el tiempo de contacto del fármaco en la superficie ocular y/o dérmica, incrementar la retención del fármaco y aumentar la eficacia analgésica y antiinflamatoria de PF. El análisis morfológico de las PF-NPs incorporadas en el hidrogel mostro que el diámetro de partícula fue similar al observado para las PF-NPs en suspensión. La evaluación del perfil de liberación in vitro de PF reveló que las formulaciones PF-NPs, HG_PF-NPs y HG_PF-NPs-Azona exhiben una liberación sostenida del fármaco comparado con la solución de fármaco libre. Por otra parte, los resultados obtenidos a partir de los ensayos de permeación transcorneal ex vivo y eficacia antiinflamatoria in vivo pone de manifiesto que las formulaciones de HG_PF-NPs-Azona (azona 1% p/p) pueden ser un sistema más efectivo y apropiado en el tratamiento del edema ocular. Adicionalmente, estas formulaciones mostraron una tolerancia ocular óptima por el método HET-CAM y el test de Draize. Los resultados observados a partir de la permeación transdérmica ex vivo y la eficacia antiinflamatoria in vivo de PF sugieren que la aplicación dérmica de la formulación HG_PF-F2NPs puede ser un sistema más apropiado para tratar el edema de la superficie de la piel, respecto al resto de formulaciones ensayadas. Ningún signo de irritación fue detectado tras la aplicación démica de las formulaciones semisólidas de PF en ausencia o en presencia de un 3% de azona.
Interfaces proteína-proteína: un nuevo tipo de diana terapéutica
(Universitat de Barcelona, 2015-02-20) Pujadas Lorente, Montserrat; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En esta tesis se presentan las Interfaces Proteína-Proteína como un Nuevo Tipo de Diana Terapéutica a explotar, a través del estudio de un sistema de dos proteínas implicado en la quimiotaxis bacteriana: CheA/CheY. En la segunda parte de la tesis, presentamos la regulación alostérica por fosforilación en HDAC8, a través de esta proteína poco conocida todavía, queremos vislumbrar el método de propagación que sigue a la entrada del fosfato en el lugar alostérico, y cómo en última instancia esto genera la inhibición de la función desacetilasa de la proteína. Para la primera parte de la tesis, primeramente, se elige un sistema tipo de dos proteínas, en base a un cribado inicial del PDB en busca de cavidades capaces de unir moléculas pequeñas tipo fármaco, que reúnan una serie de características, y posterior caracterización de la cavidad a estudiar. Tras estre cribado, se eligió el sistema CheA/CheY como sistema tipo. Paralelamente, otros miembros del grupo, seleccionaron compuestos comerciales capaces de unirse a la interfaz, mediante programas de docking como rDock, a fin de seleccionar compuestos con posible acción estabilizadora del complejo (compuestos con acción PP-‐glue). Más adelante, también se adquirieron 4 fragmentos derivados de la benzen-‐sulfonamida. La afinidad del complejo y cómo los compuestos le afectaban, fue estudiado: mediante técnicas biofísicas, como SPR y Termoforesis. Mediante la primera técnica, caracterizamos la afinidad del complejo y ensayamos los más de 100 compuestos que se adquirieron, en busca de compuestos activadores, que actuasen como PP-‐ glue. Una vez encontrados, estos se estudiaron más a fondo mediante Termoforesis a fin de saber cuál es la afinidad de cada uno de ellos por cada una de las proteínas del sistema, cómo afecta a la Kd del complejo la adición de estos, y si esta es dependiente de la concentración. Una vez seleccionados los compuestos activadores, se quiso comprobar mediante cristalografía que el luegar de unión de estos era el predicho mediante técnicas computacionales. Para ello, primeramente se obtuvo la estructura cristal del sistema de dos proteínas a 2,5Å. Posteriormente, se buscó obtener la estructura cristal del mismo complejo, esta vez en presencia de los compuestos activadores y fragmentos, mediante co-cristalización y soaks. También realizamos una serie de experimentos in vivo, aprovechando la implicación del sistema en la quimiotaxis bacteriana y que la alteración del mismo puede traducirse en un cambio en la motilidad bacteriana, apreciable macroscópicamente. Para ello, realizamos una batería de cultivos en agar motil, en presencia de atractantes, repelentes, dichos compuestos, y observamos la distancia recorrida en cada uno de los casos. Para la segunda parte de la tesis y el estudio del alosterismo en HDAC8, realizamos una serie de mutaciones estratégicas, determinadas mediante dinámicas moleculares previas, realizadas por miembros del grupo, y observamos mediante Western Blot, cómo afectan estas mutaciones al nivel de fosforilación final de la proteína, y mediante ensayos in vitro observamos su correlación con la actividad desacetilasa final de cada uno de los mutantes.
Protein solvation preferences: applications to drug discovery
(Universitat de Barcelona, 2014-12-18) Álvarez García, Daniel; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa]El diseño de fármacos asistido por ordenador es actualmente un actor fundamental en el proceso de descubrimiento de nuevos fármacos. Las aproximaciones basadas en estructura usan la información estructural de la Diana terapéutica para proponer moléculas activas y seguras. Sin embargo, el proceso dista de ser sencillo y nuevas metodologías están continuamente siendo investigadas para solventar las limitaciones actuales, siendo la flexibilidad de la diana y el tratamiento y la estructura del agua en la cavidad, dos factores usualmente obviados o simplificados. Como ha sido demostrado por varios experimentos de NMR y cristalografía, moléculas pequeñas de solventes orgánicos (p.e. etanol, acetamida o acetonitrilo), son capaces de identificar sitios de unión y proporcionan pistas para el diseño racional de nuevas moléculas bioactivas. MDmix es un método basado en simulación molecular que explota dicho fenómeno in silico. Usando mezclas de moléculas orgánicas pequeñas y agua, cada una con propiedades químicas diferentes, se identifican mapas energéticos de interacción sobre la superficie de la diana. Esta información nos permite identificar sitios de unión para ligandos y caracterizar dicha interacción para guiar el proceso de identificación de hits y la optimización de cabezas de serie. El trabajo presentado en esta tesis se puede dividir en dos publicaciones principales: En la primera, el efecto de la flexibilidad de la diana es estudiado para establecer unas guías de actuación a la hora de simular el sistema. Encontramos que la flexibilidad es fundamental a la hora de identificar cavidades inducidas o con alto grado de flexibilidad pero, a la vez, la interpretación de los resultados es mucho más compleja cuando hay cambios conformacionales. Por otra banda, aplicando restricciones suaves a la movilidad de los átomos, se gana reproducibilidad en los resultados y los errores en la estimación energética son mínimos. En la segunda publicación, se estudió el uso de diferentes mezclas de solventes para la identificación de farmacóforos experimentales en dos sistemas test (heat shock protein 90 y HIV proteasa 1). El tratamiento explícito del agua proporciona mapas energéticos capaces de identificar correctamente los puntos de interacción más favorables con una precisión sin precedentes cuando se compara con otros métodos. Además, demostramos como los mapas energéticos obtenidos para las moléculas de agua son capaces de discernir entre aguas desplazables y no desplazables por un potencial ligando. La información extraída de dichos mapas puede ser de alta utilidad para guiar la identificación de nuevas moléculas activas y para la optimización de la potencia de ligandos ya identificados. Finalmente, se presenta un programa de código abierto escrito en python cuyo objetivo es facilitar el uso de la metodología así como su adopción en cualquier proyecto de diseño de fármacos. En el capítulo final se discuten posibles mejoras y aplicaciones prácticas del método en proyectos actualmente en investigación y direcciones futuras a seguir. MDmix, siendo un método basado en simulación molecular, permite incorporar la flexibilidad de la diana y tratar explícitamente el efecto del solvente. Por ello, ofrece ventajas significativas sobre aproximaciones tradicionales en la identificación de sitios de unión y su caracterización. Siendo aplicable sobre cualquier diana, aún sin conocimiento previo, ofrece una nueva alternativa en el siempre desafiante proceso del diseño de fármacos.
Modelización en diseño de fármacos: Exploración conformacional de ligandos y diseño de inhibidores multipotentes
(Universitat de Barcelona, 2014-12-12) Juárez Jiménez, Jordi; Luque Garriga, F. Xavier; Pouplana Solé, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La presente Tesis Doctoral, presentada como compendio de publicaciones, tiene como objetivo general la aplicación de diversas técnicas computacionales al estudio de los determinantes moleculares que subyacen en la interacción ligando-receptor. Para ello, se han definido dos líneas de investigación, una de desarrollo metodológico y otra de aplicación. En el capítulo metodológico se incluye un único manuscrito (Juárez-Jiménez et. al., J. Phys. Chem. B, 2014) en el que extiende la metodología Multinivel desarrollada por Forti et. al. (J. Chem. Theory Comput. 2012) al uso de campos de fuerza de mecánica clásica. Dicho estudio es relevante de cara a optimizar la exploración de las preferencias conformacionales de fármacos y otras pequeñas moléculas orgánicas. En concreto, se evalúa el uso de campos de fuerza clásicos para llevar a cabo un muestreo a bajo nivel de teoría de las preferencias conformacionales de moléculas tipo feniletilamina y se comprueba que los resultados obtenidos son consistentes con los datos experimentales descritos en la bibliografia y con los resultados obtenidos con la implementación original del método, donde se empleaba el hamiltoniano semiempírico RM1. En segundo lugar, la nueva implementación del método se utiliza para predecir las preferencias conformacionales del antibiótico estreptomicina, obteniéndose resultados similares a los obtenidos experimentalmente por resonancia magnética nuclear, si bien sugerentes de posibles mejoras en la metodología. El capítulo de aplicación incluye tres publicaciones (Bolea et. al. J. Med. Chem. 2011; Juárez Jiménez et. al. BBA Proteins and Proteomics, 2014 y Viayna et. al. J. Med. Chem. 2014), obtenidas a partir de una colaboración multidisciplinar entre diversos grupos de diseño, síntesis y evaluación farmacológica de compuestos de potencial interés en la enfermedad de Alzheimer. Concretamente, se describe el desarrollo de dos familias de fármacos multipotentes: compuestos iMAO-iAChE y compuestos iBACE-1-iAChE, centrándose la discusión en la elucidación de los modos de unión y las relaciones estructura-actividad de dos series de compuestos multipotentes a sus principales dianas terapéuticas mediante la combinación de técnicas de modelización molecular, tales como el docking y la dinámica molecular. En el primer caso, se describen modelos de unión a AChE y MAO de compuestos híbridos donepezilo-PFN9601, abordándose en detalle los determinantes moleculares de las relaciones estructura-actividad y proponiéndose las causas estructurales del diferente comportamiento cinético observado para el mismo inhibidor en MAO A y en MAO B. Con el fin de mejorar el perfil farmacológico de los inhibidores, también se describe, mediante el empleo de compuestos selectivos MAO A, los determinantes moleculares de la selectividad entre las isoformas A y B que muestran algunos inhibidores de MAO. En el segundo caso, la modelización molecular ha permitido proponer un modo de unión a BACE-1 de compuestos híbridos huprina Y-rheína. Dicho modo de unión, sitúa la unidad de huprina Y en el sitio catalítico, mientras que sugiere que la unidad de rheína quedaría acomodada en un sitio de unión diferente al sitio catalítico, que hasta la fecha no ha sido explorado mediante técnicas de diseño racional de fármacos. Ello abre la puerta al desarrollo de nuevos compuestos que interaccionen con BACE aprovechando dicho centro de unión.
Development of multifunctional polymeric nanoparticles by nano-emulsion templating as advanced nanocarriers targeting the blood-brain barrier
(Universitat de Barcelona, 2015-01-21) Fornaguera Puigvert, Cristina; Solans Marsà, Conxita; Calderó Linnhoff, Gabriela; García Celma, Ma José; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] Les nanopartícules polimèriques multifuncionals (NPs) representen una alternativa prometedora pel tractament de malalties neurodegeneratives, a través de l’administració intravenosa (i.v.), ja que els tractaments actuals provoquen molts efectes secundaris. Les NPs, en canvi, si estan correctament dissenyades, poden actuar específicament en el teixit diana. Ja que l’òrgan diana és el cervell, és necessari un element de vectorització per poder creuar la barrera hemato-encefàlica (BBB). En aquest context, l’objectiu de la present tesi és l’obtenció de NPs com a sistemes avançats d’alliberament de principis actius que travessin la BBB. Es van obtenir NPs a partir de nano-emulsions (NE) plantilla, emprant l’àcid poli-(làctic-co-glicòlic) com a polímer i el mètode d’inversió de fases a temperatura constant per emulsionar, seguit d’evaporació de solvent per obtenir NPs. Les NPs obtingudes tenen mides apropiades per l’administració i.v.. Es va aconseguir encapsular un fluorescent i NPs magnètiques dins les NPs polimèriques, per fer-les servir com a sistemes d’imatge. També es van encapsular fàrmacs per usar-les com a sistemes terapèutics. En tots els casos, es van aconseguir eficiències d’encapsulació molt elevades i un alliberament del fàrmac controlat i prolongat en el temps. A més, es va aconseguir funcionalitzar la superfície de les NPs amb diferents elements. Es van unir covalentment dendrons catiònics per posteriorment unir oligonucleòtids electrostàticament. També es va afegir una coberta exterior de polietilenglicol per protegir el material genètic. Per altra banda, es va funcionalitzar la superfície de les NPs amb un anticòs específic contra el receptor de la transferrina, sobreexpressat a la BBB. A continuació, es van fer assajos in vitro, que van posar de manifest que les NPs no són citotòxiques ni hemolítiques. També es va estudiar l’eficiència de transfecció cel•lular del material genètic, arribant a eficiències de transfecció equivalents a les dels vectors comercials. Assajos in vivo van permetre confirmar el pas a través de la BBB, sobretot de les NPs funcionalitzades amb l’anticòs. Els resultats obtinguts permeten concloure que s’ha aconseguit dissenyar noves NPs polimèriques a partir de NE, apropiades per l’administració i.v. i amb capacitat de travessar la BBB.
Estudis fisicoquímics de diferents seqüències peptídiques del virus de l’Hepatitis G
(Universitat de Barcelona, 2015-01-09) Alay Romero, Maria Teresa; Busquets i Viñas, Ma. Antonia; Prat Aixelà, Josefa; García López, María Luisa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] El contingut de la tesi radica fonamentalment en l’ús de models de membrana biològica per a l’estudi del comportament fisicoquímic de seqüències peptídiques derivades del GB-virus C (GBV-C). La concomitància d’aquest virus amb el virus causant del SIDA (HIV) ha demostrat disminuir notablement la virulència d’aquets darrer. És per això que és important conèixer el comportament de pèptids que són fragments de les proteïnes del GBV-C per a posteriori poder enfocar l’estudi de la inhibició de la capacitat infectiva del HIV per part del GBV-C. Es tracta d’un estudi bàsic però amb resultats que contribueixen al disseny de noves estructures peptídiques per a ser emprades com una nova estratègia per a enfocar el tractament de la SIDA. Finalment indicar que aquest tema s’engloba dins del camp de la nanotecnologia pel que fa a l’ús de liposomes en els distints estudis presentats. Els resultats obtinguts es presenten en les següents publicacions: 1. Alay, M.; Busquets, M.A., Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Prat, J. Merocyanine 540 for spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of hepatitis G virus with liposomes. Luminescence, 17: 263-264 (2002). 2. Alay, M.; Prat, J.; Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of Hepatitis G virus with bilayers. Talanta, 60: 269-277 (2003). 3. Alay, M.; Prat, J.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Effect of merocyanine 540 on Langmuir-Blodgett films and liposomes of zwitterionic, anionic and cationic lipid composition. Journal de Physique IV. 113: 3 -6 (2004) 4. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Analysis of the effect of a peptide sequence of the E2 protein (HGV/GBV-C) on the physicochemical properties of zwitterionic and negatively charged bilayers. Luminescence 20: 445-450 (2005) 5. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of E2 (GBV-C/HGV)-derived peptides with liposomes: fluorescence anisotropy and fluorescence resonance energy transfer methods. Luminescence 21: 360 -361 (2006) 6. Alay, M.; Haro, I., Girona, V.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of two overlapped synthetic peptides from GB virus C with charged mono and bilayers. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces105: 7 -13 (2013)
Estudio biofarmacéutico de flavanonas isoprenílicas antiinflamatorias libres y vehiculizadas en sistemas nanoestructurados para aplicación tópica
(Universitat de Barcelona, 2014-03-24) Domínguez Villegas, Valeri; García López, María Luisa; Calpena Campmany, Ana Cristina; Garduño Ramírez, María Luisa del Carmen; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] Los tratamientos considerados para el dolor y la inflamación han demostrado efectos colaterales, por ello, el descubrimiento e investigación de nuevos fármacos de origen natural son considerados como alternativa favorable. Los flavonoides comprenden un grupo de compuestos del tipo fenólico que abarcan una gran variedad de sustancias dentro de los Productos Naturales. Es por ello que en el presente trabajo se asilaron cuatro flavanonas isoprenílicas: 5, 7-dihidroxi-6-metil-8-prenilflavanona (I), 5, 7-dihidroxi-6-metil-8-prenil-4’-metoxi-flavanona (II), 5, 7-dihidroxi-6-prenilflavanona (III) y 5-hidroxi-7-metoxi-6-prenilflavanona (IV) a partir del extracto metanólico del las hojas de la especie vegetal Eysenhardtia platycarpa. A estas flavanonas se les evaluó su eficacia antiinflamatoria en un modelo de TPA en oreja de ratón, su capacidad antioxidante utilizando DPPH como radical libre y finalmente se hicieron pruebas de citotoxicidad frente a Artemia salina. Posteriormente, se elaboraron nanoformulaciones, en específico nanoemulsiones (NEs) y nanopartículas (NPs) a partir de las cuatro flavanonas Las NPs fueron del tipo polimérico preparadas mediante el método del desplazamiento del disolvente descrito por Fessi utilizando como polímero el PLGA 50/50 a la concentración de 1.5 mg/mL de principio activo. Estas NPs mostraron un tamaño de partícula medio de 156 - 202 nm con una carga negativa entre -25 and -30 mV. Los estudios de microscopía de transmisión electrónica (TEM) evidencian que las NPs tienen forma esférica obteniéndose de esta manera nanoesferas con un patrón denso uniformemente distribuido. Para el caso de las NEs se eleboraron empleando el método de pesada directa a una concentración de 0.5 % de principio activo. Los estudios de TEM y DLS (Dynamic light scattering) indican que se obtuvieron NEs del tipo W/O, de forma esférica y una estructura micelar de las gotas que oscilaban entre 60 y 70 nm; obteniéndose un menor tamaño de gotícula que en el caso de las NPs. A partir de las NPs y NEs se realizaron ensayos de liberación donde se encontró que los compuestos vehiculizados en nanopartículas liberan más rápido que en naoemulsiones; a las 2 h y a las 10 h. respectivamente y en ambos casos, las flavanonas (I) y (III) son las que mayor cantidad de fármaco liberan a esos tiempos. De los ensayos de permeación se observó que la constante de permeación y la cantidad retenida en piel se ven incrementados para las flavanonas (I), (II) y (IV) cuando son vehiculizadas en NPs. Con base a los resultados de la presente investigación se considera que la flavanona 5-hidroxi-7-metoxi-6-prenil flavanona (III) vehiculizada en nanoemulsión y nanopartículas poliméricas presenta los mejores resultados de permeación y actividad antiinflamatoria por lo que puede ser considerado un potencial agente alternativo antiinflamatorio de uso tópico.
Péptidos derivados del GB virus C como potenciales inhibidores del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(Universitat de Barcelona, 2014-01-30) Galatola, Ramona; Haro Villar, Isabel; Gómara Elena, María José; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En los últimos años, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de nuevos fármacos inhibidores de la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) en la célula huésped. La principal ventaja de este tipo de inhibidores es que actúan como profilácticos, es decir pueden evitar la infección primaria y la integración del genoma viral en el genoma de la célula huésped. Esto implica una reducción del riesgo de sufrir efectos secundarios, y además, se evita el establecimiento y el mantenimiento de reservorios virales latentes. Estudios recientes han demostrado que pacientes coinfectados por los virus GBV-C y HIV-1, tienen una progresión más lenta de la enfermedad del SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) así como una mayor supervivencia. Los estudios realizados, hasta el momento, indican que existe un mecanismo múltiple por el que la infección del GBV-C ejerce un “efecto protector” en los pacientes infectados con HIV-1. Empleando un modelo de co-infección, se ha observado que el virus GBV-C puede inhibir la replicación del HIV-1 así como la entrada de este último en las células. Según los estudios publicados ciertas regiones peptídicas de las glicoproteínas estructurales E1 y E2 del GBV-C presentan un efecto inhibidor frente al virus del HIV-1, y parece ser que interaccionan con el péptido de fusión de la glicoproteína de envoltura gp41 del virus (PF-HIV-1). Teniendo en cuenta dichos resultados, uno de los objetivos de esta tesis doctoral es el diseño y la síntesis de derivados peptídicos pertenecientes a la región (22-39) de la proteína de envoltura E1 del virus GBV-C (E1P8), la cual en estudios previos ha mostrado una cierta actividad inhibitoria del virus del HIV-1. Se pretende mejorar la actividad antiviral del dominio peptídico E1P8 y así abordar el diseño de nuevos péptidos inhibidores de la entrada del virus del HIV-1. Se pretende evaluar el efecto de los diferentes aminoácidos en la estructura primaria de la secuencia nativa, y de su carga neta, en la actividad anti-HIV-1 del péptido E1P8. Con esta finalidad, se ha realizado un “scanning” posicional mediante la síntesis de 23 péptidos lineales, análogos del E1P8, en los que se ha sustituido cada uno de los aminoácidos de la secuencia original por alanina, y cambiado la carga neta del péptido mediante la sustitución de aminoácidos cargados por aminoácidos neutros. A continuación, se ha llevado a cabo el diseño y la síntesis de nuevas formas de presentación peptídica (varios lipopéptidos y un péptido cíclico). El estudio de la interacción entre los derivados peptídicos del E1P8 y el PF-HIV-1 se ha realizado mediante ensayos biofísicos, utilizando modelos de membrana. Para ello, se han utilizado técnicas fluorimétricas, Balanza de Langmuir, Microscopia de fluorescencia, Dicroísmo Circular y Resonancia de Plasmón Superficial. La actividad biológica de los péptidos se ha estudiado utilizando ensayos celulares y ensayos de inhibición de replicación del virus HIV-1. Los resultados obtenidos permiten concluir que tanto la estructura primaria como la carga neta de E1P8 son esenciales para su actividad anti-HIV-1. Los lipopéptidos interaccionan con el PF-HIV-1 e inhiben la infección del HIV-1 con una mayor actividad que la secuencia nativa. El péptido E1P8 ciclado es el que presenta la mejor actividad inhibitoria del virus HIV-1, por lo que podría considerarse como punto de partida para el diseño de péptidos derivados del GBV-C con aplicación en futuras terapias anti-HIV-1.
Investigation of the phospholipid peripheral region of lactose permease in model membranes
(Universitat de Barcelona, 2013-11-07) Suárez Germà, Carme; Borrell Hernández, Jordi; Domènech Cabrera, Òscar; Montero Barrientos, Ma. Teresa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] La interacció entre una proteïna de membrana i els fosfolípids que l’envolten és crucial pel bon plegament i la correcta funció de la proteïna. Aquesta tesi està centrada en la investigació de la interacció entre la Lactosa permeasa (LacY), un paradigma dels transportadors secundaris situat a la membrana interna d’Escherichia coli, i sistemes models que mimetitzen el seu entorn lipídic. Aquest treball representa una contribució al camp a través de l’estudi de la interacció a dos nivells: (i) la interacció entre LacY i els fosfolípids presents a la regió anular propera a la proteïna ha estat estudiada a través de mesures de FRET entre un mutant de LacY amb un únic triptòfan i diversos fosfolípids marcats i (ii) la interacció entre LacY amb els fosfolípids més llunyans o bulk s’ha investigat a través de làmines de lípid i proteïna sobre un suport, les quals s’han analitzat a partir de diversos modes de microscòpia de força atòmica (topografia, espectroscòpia de força i force-volume). En primer lloc, s’ha validat la preferència de LacY pels fosfolípids en fases fluïdes (Lα). A més, s’ha confirmat una composició lipídica entre la regió anulars i el bulk. Així, els fosfolípids bulk, considerats com a fosfolípids en fase Lα, tenen PG com a principal component, mentre que PE és el major component de la regió anular. Això sembla indicar una selectivitat entre LacY i els fosfolípids anulars. En segon lloc, s’ha descrit que la selectivitat de LacY per fosfolípid determinat a la regió anular està relacionada amb (i) càrrega neutra i (ii) curvatura espontània (C0) negativa. A més, D68 s’ha assenyalat com un aminoàcid important per la selectivitat de la proteïna envers els lípids anulars. Finalment, s’ha descrit una interacció recíproca entre LacY i els lípids bulk. Així, la presencia de la proteïna modifica la topografia i la nanomecànica del sistema lipídic, especialment de la fase Lα, i, alhora, la nanomecànica de la pròpia LacY varia segons la matriu lipídica que l’envolta. En conseqüència, la composició lipídica de la bicapa sembla determinar les forces que governen l’estreta interacció de LacY amb la membrana i, per tant, aquesta composició és decisiva per la correcta inserció i activitat de la proteïna.
Nanopartículas magnéticas para aplicaciones biomédicas
(Universitat de Barcelona, 2013-01-17) García Jimeno, Sonia; Estelrich i Latràs, Joan; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El objetivo general que se ha planteado en este trabajo de tesis ha sido la obtención de nanopartículas magnéticas (NMPs) que puedan presentar aplicaciones biomédicas. El tipo de NPMs desarrolladas han sido, por una parte, magnetoliposomas, y, por otra, un ferrofluido formado por magnetita estabilizada con polietilenglicol (PEG). Como premisas de partida, se ha fijado que cualquier muestra obtenida de tener un tamaño inferior a 200 nm, estabilidad mínima de 24 horas, y un comportamiento propio de los ferrofluidos ante un campo magnético. Sobre aquellos productos que cumplían los citados requisitos se han ido introduciendo modificaciones hasta obtener un producto estable con las propiedades antes indicadas. Se estudiaron dos aplicaciones terapéuticas de las partículas sintetizadas: como sistemas adecuados para terapia hipertérmica, y como sistemas transportadores de fármacos dirigidos bajo la acción de un campo magnético. Los magnetoliposomas obtenidos encapsulaban o bien un ferrofluido aniónico comercial, o bien el ferrofluido obtenido con PEG en liposomas empleando el método de fase reversa seguida de extrusión. Estos liposomas presentaban un diámetro de partícula de unos 200 nm, eran superparamagnéticos, muy estables y con las tasas de encapsulación más elevadas que las obtenidas por otros métodos. Se ha obtenido un ferrofluido por co‐precipitación de sales férricas en presencia de PEG. El PEG no estaba modificado y su interacción con la magnetita es de tipo físico. Se han obtenido nanopartículas de magnetita con un tamaño medio de 12 nm. Se ha estudiado el efecto de hipertermia y termoablación inducida de estas NPMs en fantoms, materiales con propiedades dieléctricas y de permitividad semejantes a los tejidos reales sobre los que se pretende aplicar la terapia. Se comprobó el funcionamiento de los aplicadores de radiación, una guía de onda y una antena de microondas, así como, el uso de las NPMs como potenciadores y como agentes para focalizar la energía en la zona deseada. Se demostró, que utilizando en conjunto el aplicador con las NPMs es posible focalizar la energía sobre el tumor evitando el calentamiento del tejido sano circundante, lograr incrementos de temperatura en el rango terapéutico y controlar los incrementos de temperatura en el tejido. Se ha estudiado la biodistribución de los magnetoliposomas en ratones a los que se les había inducido inflamación. Se confirmó que las NPMs se acumulan principalmente en el foco inflamatorio sin la necesidad de dirigirlos mediante un campo magnético externo. En un segundo estudio se observó que, además, si se le aplica en la zona inflamatoria un campo magnético externo, la cantidad de NPMs aumenta en el exudado, y disminuye en sangre, hígado y bazo. Esto demuestra que los magnetoliposomas pueden ser utilizados como vehículo de transporte, para dirigir fármacos a zonas de interés terapéutico, con lo que podríamos reducir la dosis de fármaco administrada y aumentar la eficacia del tratamiento y prevenir los efectos secundarios.
Estudi de la formació de nanopartícules polimèriques obtingudes a partir de nanoemulsions de fase externa aquosa i associació d’antiinflamatoris no esteroïdals
(Universitat de Barcelona, 2011-04-07) Morral Ruíz, Genoveva; García Celma, Ma José; García López, María Luisa; Solans Marsà, Conxita; García López, María Luisa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] Les nano-emulsions són emulsions amb una mida de gota molt petita i uniforme, normalment compresa entre 20 i 200 nm, que poden formar-se a baixes concentracions de tensioactiu. Degut a les seves propietats específiques (mida de gota, elevada estabilitat cinètica i transparència òptica) les nano-emulsions tenen importants aplicacions en indústria química, cosmètica i farmacèutica. En aquest sentit, una de les principals aplicacions tecnològiques és la seva utilització com a medi de polimerització per a l’obtenció de nanopartícules. Les nanopartícules polimèriques poden definir-se com a sistemes col•loïdals sòlids amb un diàmetre comprès entre 10 i 1000 nm en les quals el principi actiu es pot trobar solubilitzat, atrapat, encapsulat, adsorbit o fins i tot unit a la superfície d’una matriu polimèrica que actua com a vehicle permetent l’alliberació selectiva del fàrmac en el lloc d’acció. Per tant, mitjançant la formació de nanopartícules s’aconsegueix dotar al sistema col•loïdal inicial d’una certa rigidesa morfològica que conjuntament amb la petita mida de partícula fan que aquestes composicions siguin idònies com a sistemes d’alliberació controlada de fàrmacs. D’acord amb aquestes premisses, l’objectiu principal d’aquest treball d’investigació ha estat estudiar la formació de nanopartícules polimèriques a partir de nano-emulsions de fase externa aquosa (O/W), obtingudes per mètodes d’emulsificació de baixa energia, en sistemes aigua/ tensioactiu no iònic: co-tensioactiu/ component oliós amb excipients biocompatibles i adequats per a l’administració per via parenteral i tòpica. Una de les fites més importants d’aquest treball d’investigació ha consistit en desenvolupar sistemes nanoestructurats recoberts amb polietilenglicol i biomaterials que podrien incrementar la biodisponibilitat d’aquests sistemes col•loïdals. Per tal d’assolir aquest objectiu, en una primera etapa es va estudiar la formació, caracterització i propietats de les nano-emulsions O/W i posteriorment es va procedir a l’elaboració de les nanopartícules polimèriques. En aquesta segona etapa, també es va estudiar la influència dels paràmetres de composició així com també de la temperatura i temps de polimerització en la preparació de les nanopartícules. Els sistemes de nano-emulsions i nanopartícules es van caracteritzar per Espectroscòpia de Correlació Fotònica (DLS), Microscòpia Electrònica de Transmissió (TEM), Microscòpia de Força Atòmica (AFM) i Microscòpia confocal. La formació de polímers de poliuretà i poliurea es va constatar a través de les anàlisis dels espectres obtinguts per Espectroscòpia d’Infraroig per Transformada de Fourier (FT-IR). Finalment, es va incorporar un fàrmac antiinflamatori no esteroïdal (ketoprofèn) en els sistemes esmentats i es van dur a terme estudis d’incorporació, alliberació i permeació cutània del fàrmac. Mitjançant els estudis de comportament fàsic s’han identificat regions on es formen nano-emulsions O/W amb una elevada concentració d’aigua (90% i 95% en pes) i components utilitzats per a la preparació de nanopartícules. Aquestes nano-emulsions O/W presenten una mida de gota compresa entre 13 i 42 nm, una elevada estabilitat cinètica i una baixa polidispersitat que les fa apropiades per a ser utilitzades com a sistemes d’alliberació controlada de fàrmacs i com a medi de polimerització per l’elaboració de nanopartícules polimèriques. Destacar també, que s’ha aconseguit la formació de nanopartícules de poliuretà i poliurea recobertes amb polietilenglicol i diferents biomaterials amb un diàmetre de partícula inferior a 100 nm i una baixa polidispersitat (<0,150) que presenten una elevada estabilitat cinètica, a partir de nano-emulsions obtingudes mitjançant mètodes d’emulsificació de baixa energia. Aquests sistemes serien adequats per a la vehiculització de principis actius amb una baixa solubilitat en aigua ja que es van aconseguir incorporar concentracions elevades d’un fàrmac model, ketoprofèn, amb una elevada eficiència d’associació (≥ 80 %). Per altra banda, els estudis de cessió van posar de manifest que el principi actiu es capaç d’alliberar-se completament des de les formulacions cap a una solució receptora seguint una cinètica d’ordre zero.
Development of nanovectors for the targeted drug delivery of antimalarials
(Universitat de Barcelona, 2013-02-11) Urbán, Patricia; Fernàndez Busquets, Xavier; Estelrich i Latràs, Joan; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[eng] Malaria is arguably one of the main medical concerns worldwide because of the numbers of people affected, the severity of the disease, and the complexity of the life cycle of its causative agent, the protozoan Plasmodium sp. The clinical, social and economic burden of malaria has led for the last 100 years to several waves of serious efforts to reach its control and eventual eradication, without success to this day. At present, administration methods of antimalarial drugs release the free compound in the blood stream, from where it can be significantly removed by many tissues and organs, thus reducing its availability for Plasmodium-infected erythrocytes. Due to this lack of specificity regarding the target cells, current oral or intravenous delivery approaches for most antimalarial drugs require high doses. However, unspecificity of toxic drugs demands low concentrations to minimize undesirable side-effects, thus incurring the risk of sublethal doses favouring the appearance of resistant pathogen strains. Targeted nanovector systems can fulfill the objective of achieving the intake of total doses sufficiently low to be innocuous for the patient but that locally are high enough to be lethal for the malaria parasite. With the advent of nanoscience, renewed hopes have appeared of finally obtaining the long sought-after magic bullet against malaria in the form of a nanovector for the targeted delivery of antimalarial drugs exclusively to Plasmodium-infected cells. We work on the development of antimalarial drug-carrying nanovectors specifically targeted to Plasmodium-infected red blood cells (pRBCs). Our first immunoliposomal prototype delivers its contents exclusively to pRBCs containing the P. falciparum late forms trophozoites and schizonts, and improves on average tenfold the efficacy of the antimalarial drugs chloroquine and fosmidomycin. Using chloroquine concentrations well below its IC50, and by modifying parameters such as liposome size, density of targeting antibodies on the liposome surface, targeted antigen, and intraliposomal drug concentration, we approach 100% of parasitemia reduction both in vitro and in vivo using a murine model for P. falciparum malaria. We are working in the improvement of the nanovector through modification of (i) the targeting element: better antibodies, non-protein molecules such as DNA aptamers and polysaccharides, (ii) the encapsulated drug(s), and (iii) the type of nanocapsule, making special emphasis on polymeric structures. Our objective in the short term is the design of a nanostructure adequate to enter the preclinical pipeline as an economically affordable new antimalarial therapy.
Flexibilidad conformacional de moléculas bioactivas: implicaciones en diseño de fármacos y función de globinas
(Universitat de Barcelona, 2011-09-06) Forti, Flavio; Luque Garriga, F. Xavier; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El estudio de la unión de un ligando con un receptor es de particular relevancia en el desarrollo de fármacos, donde se persigue encontrar un ligando con elevada afinidad hacia un determinado receptor. El ligando se une al receptor en el denominado “sitio de unión”. El proceso de unión puede dividirse en 2 etapas: i) difusión del ligando a través del receptor hasta el sitio de unión, y ii) la selección de aquella conformación (bioactiva) que cumple con las características geométricas y fisicoquímicas que le permiten unirse al receptor. En la presente memoria se ha estudiado la difusión molecular del ligando a través de la matriz proteica hasta el sitio de unión, así como la selección de la conformación bioactiva implicada en el reconocimiento ligando-receptor. En la primera parte se ha desarrollado una metodología Multinivel que proporciona un método eficiente para la exploración conformacional de moléculas tipo fármaco, permitiendo identificar estructuras estables y su población relativa. Hace uso de una exploración conformacional a nivel RM1 y posterior refinamiento a nivel más robusto de teoría: B3LYP y MP2. Se consigue así un buen balance costo/calidad para la estimación precisa de la población relativa de los confórmeros relevantes. Para compuestos en solución se utiliza la metodología de solvente continuo MST. Esto hace necesario derivar una nueva versión parametrizada del modelo MST para el hamiltoniano RM1. El modelo parametrizado ha probado proveer estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos neutros. El tratamiento de compuestos iónicos es más delicado, dado que existe una dependencia fuerte entre el factor de escalado utilizado para modular la frontera electrostática entre el solvente y el soluto y el grupo ionizable. El uso de un factor de escalado adaptado al entorno químico provee una estrategia computacional viable para obtener estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos cargados. Los resultados obtenidos para la histamina neutra son alentadores considerando la complejidad conformacional y tautomérica que presenta y coinciden con la mayoría de los estudios previos. En la segunda parte, se ha estudiado el impacto de las distorsiones de la planaridad del grupo hemo en la afinidad por O(2). Se halló que éstas pueden modular la afinidad de una globina por ligandos bimoleculares. Las distorsiones resultan en una disminución de la afinidad por O(2).con excepción del modo breathing, que implica la compresión-expansión del grupo hemo en el plano. El “breathing” positivo del hemo de la protoglobina “Methanosarcina Acetivorans” (MaPgb) podría contribuir a la alta afinidad por O(2) reportada dado que no presenta efecto distal, habitualmente responsable de la alta afinidad hallada en otras globinas. Por otra parte, la accesibilidad del ligando a esta proteína se logra a través de un sistema de túneles novedoso definido entre las hélices G y B (túnel 1) y B y E (túnel 2). El túnel 2, a diferencia del 1, está siempre abierto. Phe(145)G8 se halla en 2 conformaciones: abierta y cerrada, que regula la migración de ligandos a través del 1. La dimerización y la presencia de ligando unido al hemo facilitan la apertura del 1. La presencia del ligando unido al hemo es detectada por Phe(93)E11, y transmitida a Phe(145)G8 a través del cambio de las hélices B y E. Esto proporciona una explicación a los estudios cinéticos de Cristiano Viappiani. Cabe pensar que las conformaciones de ligación lenta y rápida reflejan la apertura del túnel 1 cuando se ha fijado un primer ligando en el grupo hemo. MaPgb podría participar en un proceso bimolecular, donde la entrada de un ligando facilitara de un segundo.
Conformational variability: implications for biomolecular activity and in drug design
(Universitat de Barcelona, 2012-05-21) Bhattacharyya, Mousumi; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[eng] Formation of a protein-ligand complex is opposed by the loss of rotational, translational and conformational degrees of freedom, but if the ligand binds in a conformation that does not corresponds to the global minimum, an energetic penalty should also be expected. Although it is well known that the bioactive conformation rarely corresponds to the global minimum identified with current small-molecule force fields, there is no consensus yet about how frequently this occurs in reality or about the maximal conformational penalty that a ligand can attain. Here we investigate this aspect of molecular recognition, using a diverse set of 92 drug-like ligands from the PDB. The global minimum is obtained minimizing a diverse set of conformations for each ligand, while the bioactive conformation results from a restrained minimization of the crystallographic structure. Optimization at B3LYP/6-31D(d) level of theory in the presence of a reaction field (PCM solvation), followed by single point RI-MP2//aug-cc-pVDZ provides average penalties of 2.5 kcal/mol, and only 15% of structures have energies above 5 kcal/mol. Using these values as reference, common force fields and simpler solvation models are evaluated. Depending on the choice of force field, the corresponding values range between 10 and 5 kcal/mol and between 85% and 40%, respectively. Interestingly, an inverse relationship is found between the level of theory and the average internal energy. Contrary to previous reports, we find that the poor performance obtained with molecular mechanics force-fields is more frequently due to inaccuracies in the free energy of solvation provided by the Generalized Born solvation method than to the in vacuum internal energy provided by the force field. This study provides the most accurate estimate of the conformational penalties of bioactive conformations to date, as well as a benchmark to assess the accuracy of theoretical formalisms. On the other hand, to understand at the molecular level how phosphorylation acts as a regulator of HDAC8 activity, we studied molecular dynamics of the same with and without phosphorylation on Ser39. Contrary to the initial expectations, introduction of the negatively charges phosphate does not result in a major structural rearrangement on the local environment. However, we observed that a loop distantly placed from the phospho-acceptor Ser39 in the 3D space of HDAC8 opens and de-associates itself from the deacetylase core in Wt within the simulation time span of 80ns, but this change does not occur when the protein is phosphorylated. The loop is held in place by the interactions between two conserved residues a pi-ring of Phe207 and the hydrophobic side chain of Lys202 (hence we call it KF-loop) and remains closed until 500ns. From this perspective we postulated that the decreased deacetylase activity obtained in the phosphorylated form of HDAC8 could be due to the lack of structural flexibility in this loop-region, which is involved in substrate recognition and binding. Additionally, the pathway involved in the allosteric transmission of the structural perturbation from the phosphorylation site to the KF-loop was investigated using the statistical Kullback-Leibler divergence methodology. To further test the relationship between enzymatic activity and mobility of the KF-loop, as well as to validate the putative allosteric pathway, several point mutations were designed and investigated both computationally and experimentally.

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