Tesis Doctorals - Departament - Físicoquímica

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Mostrant 1 - 20 de 27

Estudios fisicoquímicos de las construcciones tetraméricas de las secuencias peptídicas (11-25) de la proteína VP1 y (110-121) de la proteína VP3 del virus de la hepatitis A con modelos de membrana
(Universitat de Barcelona, 2002-01-01) Ortiz Rodrigo, Alba; Alsina Esteller, Ma. Asunción; Cajal Visa, Yolanda; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] a hepatitis A es una enfermedad infecciosa aguda extendida a nivel mundial, y que a pesar de no ser grave, conlleva unos elevados gastos sanitarios y afecta anualmente a 1.4 millones de personas. Puesto que las vacunas existentes, basadas en vírus inactivados, son muy caras, existe un elevado interés en el desarrollo de vacunas igualmente efectivas y seguras, pero de coste suficientemente bajo para hacerlas accesibles a los países subdesarrollados, donde la enfermedad se encuentra más extendida. Por otra parte, la mayoría de péptidos y proteínas con actividad biológica, incluyendo los antígenos peptfdicos, adquieren su conformación bioactiva al interaccionar con la membrana celular, concretamente con el entorno anfipático de la bicapa lipídica. Por ello, el estudio de la interacción péptido lípido utilizando modelos sintéticos de membrana es de gran interés para determinar las bases estructurales que definen la actividad biológica. Teniendo en cuenta estos antecedente_s, en esta tesis se pretende establecer las bases para el desarrollo de una vacuna sintética contra el virus de la hepatitis A basada en péptidos sintéticos. Los objetivos específicos son los siguientes: 1. Sintetizar antígenos peptídicos múltiples. (MAPs) basados en varias copias de una misma secuencia peptídica correspondiente a una proteína del virus de la hepatitis A. Se seleccionaransecuencias antigénicas de las proteínas VP1 y VP3 del cápside del virus, y se prepararán construcciones de cuatro de estas secuencias unidas por un núcleo ramificado de resíduos de lisina. De esta manera, se persigue incrementar la capacidad antigénica de las secuencias peptídicas sin necesidad de administrarlas conjuntamente con proteínas u otras sustancias inmunoadyuvantes. 2. Estudiar la interacción de estos antígenos peptidicos múltiples con modelos sintéticos de membrana: monocapas en la interfase agua/aire y vesículas lipídicas unilarninares. A diferencia de las membranas biológicas, que presentan gran complejidad, los modelos sintéticos propuestos presentan importantes ventajas, como su simplicidad y la posibilidad de controlar variables como1a compos ición, la curvatura, la presión lateral, etc., aspectos todos ellos de gran relevancia en la interacción de epítopos peptídicos con las membranas celulares. Se prepararán modelos de membrana de tres composiciones, con carga neta positiva, negativa o zwitterionica, a fin de elucidar los componentes electrostático e hidrofóbico en la interacción lípido-péptido. 2.1. La miscibilidad de los componentes lipídicos de los modelos de membrana seleccionados se determinará mediante la técnica de la balanza de Langmuir. 2.2. Monocapas extendidas en la interfase agua/aire: mediante la técnica de la balanza de Langp1uir, nos proponemos caracterizar la interacción de los MAPs sintetizados realizando estudios de penetración en la interfase a diferentes presiones superficiales, así como isotermas de compresión de monocapas mixtas péptido/lípido. 2.3. Vesículas lipídicas unilaminares (liposomas): se aplicará una batería de técnicas espectroscópicas para determinar la interacción de los MAPs con liposomas de las mismas composiciones empleadas en la preparación de las monocapas. Concretamente, se realizarán estudios de fluorescencia intrínseca y extrlnseca, de transferencia de energía por resonancia y de polarización de fluorescencia para determinar la unión de los péptidos a las membranas así como los posibles cambios en las propiedades fisicoquímicas de las mismas. La información obtenida podría aplicarse también al disefio de una vaclma sintética donde los MAPs se administrasen incorporados en liposomas, de manera que los epítopos adoptasen la conformación activa que facilitase su reconocimiento por las células del sistema inmune.
Estudio teórico del transporte de ligandos en proteínas y de la afinidad ligando-receptor
(Universitat de Barcelona, 2007-01-01) Bidon-Chanal Badia, Axel; Luque Garriga, F. Xavier; Orozco López, Modesto; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La eficacia de un ligando en su interacción con una macromolécula biológica depende no solo de su capacidad para interaccionar de forma complementaria y específica con la constelación de grupos químicos presentes en el centro de unión, sino también de su difusión a través de la matriz proteica para alcanzar dicho centro. Aunque difusión y unión reflejan el balance de fuerzas intermoleculares establecido entre ligando y receptor, los determinantes moleculares que subyacen pueden ser diferentes. lo que plantea un reto en su descripción mediante modelización. Con el objetivo general de identificar los determinantes moleculares asociadas a difusión y unión de ligandos en dos sistemas de relevancia biológica planteamos el análisis de dos sistemas. Por un lado, Ia acetilcolinesterasa, donde nos interesó Ia identificación de los factores que determinan la afinidad entre ligando y receptor. Por otro lado, la hemoglobina truncada N de M. tuberculosis, donde nos interesó estudiar el mecanismo molecular asociado a la difusión de ligandos a través de la matriz proteica. En cuanto al enzima acetilcolinesterasa, los objetivos específicos del presente trabajo consisten en Ia identificación de los determinantes moleculares que modulan la afinidad de tres tipos de inhibidores duales: A.l) deri vados tacrina-ftalimida, A.2) derivados tacrina-indol y A.3) deri vados tacrina-donepezilo. Todos ellos tienen como motivo común el anillo de tacrina (o cloro-tacrina), cuya presencia debería permitir la unión al centro catalítico del enzima, mientras que las estructuras consideradas difieren en la unidad química destinada a interaccionar con el centro periférico. Con respecto a la hemoglobina trucada N de M. tuberculosis, los objetivos especificos que se han planteado en este trabajo son: B. l) identificar el mecanismo molecular de migración de ligandos diatómicos (O2 y NO) hacia el centro activo, prestando especial atención a las características estructurales de las dos ramas del túnel observado en la matriz proteica, y su implicación funcional en la migración de ligandos, y B.2) establecer el mecanismo de liberación del anión nitrato, cuya salida a través del túnel observado en la estructura de rayos X no puede explicarse de forma convincente teniendo presente tanto su carga neta como su tamaño, por lo cual cabe especular con la posibilidad de que exista una ruta de eliminación altemativa no observada en la estructura cristalográfica.
Diseño y síntesis de nanosistemas derivatizados con péptidos y su aplicación en biomedicina
(Universitat de Barcelona, 2015-12-18) Vasconcelos Pacheco, Aimee; Haro Villar, Isabel; García López, María Luisa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La introducción de la nanomedicina en el ámbito de la farmacología ha revolucionado la administración de fármacos, con la aparición de nuevos tratamientos con mayor especificidad, aumentando el rendimiento biológico y farmacológico, ofreciendo así alternativas interesantes para formular nuevas moléculas. El presente trabajo tiene como finalidad el diseño de NPs poliméricas y liposomas para su aplicación en la “Terapia Ocular” y el “Diseño de inhibidores del HIV-1”. En la primera parte de este estudio se desarrollaron formulaciones que contienen Flurbiprofeno, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), que se utiliza en la cirugía de cataratas. Para ello se siguieron dos estrategias de preparación distintas: 1) NPs derivatizadas en la superficie con PEG y péptidos, abreviadas como PLGA-NPs-PEG-Péptido, 2) y la síntesis de copolímeros PLGA-PEG-Péptido con posterior preparación de las NPs, abreviadas como PLGA-PEG-Péptido-NPs. De todas las formulaciones desarrolladas, las PLGA-PEG-Péptido-NPs, en específico las PLGA-PEG-POD-NPs, han presentado los mejores resultados, obteniéndose una estrecha distribución de tamaño de partícula, una alta eficiencia de encapsulación del Flurbiprofeno y una liberación más sostenida. Asimismo, su morfología esférica se pudo comprobar mediante las técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica. Estas presentaron un tamaño de partícula apropiado, y mejoraron la biodisponibilidad y el tiempo de residencia del Flurbiprofeno en el saco conjuntival. Su menor tamaño de partícula fue un aspecto importante que condujo a una óptima tolerancia ocular y una mayor respuesta antiinflamatoria. En la segunda parte de este proyecto se estudiaron péptidos derivados de las proteínas de envoltura (E1 y E2) del virus GBV-C. Con aras de aumentar la capacidad anti-HIV-1 del péptido P6-2 (perteneciente a la proteína E2) se realizaron diferentes modificaciones químicas de su estructura: incorporación de un ácido graso en el extremo amino terminal (Pal-P6-2), obtención de NPs poliméricas del tipo PLGA-PEG-NPs-P6-2 y liposomas con diferentes composiciones, del tipo LUV, que contienen los péptidos P6-2 y la molécula quimérica resultante de la unión de este último péptido y el péptido VIR, previamente reportado por su capacidad anti-HIV-1 (VIR-P6-2). Paralelamente se han obtenido nanopartículas de PLGA derivatizadas con el péptido de fusión del HIV-1 (NPs PLGA-PF-HIV-1). Este esfuerzo atendió al creciente interés del estudio de interacción de péptidos provenientes de la proteína E1 del GBV-C. El péptido E1P8 cíclico es un fragmento de la proteína E1 del GBV-C que ha mostrado tener una elevada capacidad inhibitoria. La técnica de Diferencia de la Transferencia de Saturación (RMN-STD) ha mostrado una gran utilidad para llevar a cabo estudio de interacción receptor-ligando. Este estudio nos permitió afirmar que existe una interacción entre el péptido E1P8 cíclico y las NPs PLGA-PF-HIV-1, obteniéndose mayor intensidad en las señales de STD. La intensidad de la señales se traduce como una escala de proximidad de las distintas zonas de la estructura peptídica (E1P8 cíclico) a las NPs PLGA-PF-HIV-1, manifestando que existe interacción a nivel atómico.
Desarrollo y caracterización de liposomas para aplicación tópica de fármacos
(Universitat de Barcelona, 2015-12-21) Vázquez González, Martha Leticia; Borrell Hernández, Jordi; Calpena Campmany, Ana Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La piel es el órgano más extenso y accesible del cuerpo, debido a ello la administración de fármacos por vía tópica para efectos locales o sistémicos ha sido ampliamente documentada. A pesar de todas las ventajas que la administración tópica de fármacos ofrece, la piel y su compleja estructura formada de múltiples capas, la cual le proporciona excelentes propiedades de barrera, hacen que la administración de medicamentos a través de esta vía sea un proceso complicado. En las últimas décadas, con la finalidad de evadir la extraordinaria función de barrera del estrato córneo, se han empleado diversas estructuras nanoscópicas que han aumentado el espectro de fármacos susceptibles de ser administrados por vía tópica. Estos hechos alientan la investigación en el desarrollo de formulaciones para mejorar la administración tópica de fármacos. En la presente investigación, diseñamos formulaciones de liposomas para la administración tópica de fármacos, teniendo como hipótesis que la adición extemporánea de un activador de membrana en los liposomas, desestabiliza parcialmente las vesículas para que al contacto con la superficie de la piel humana promueva la liberación del principio activo y con ello aumente su biodisponibilidad. Se estudiaron dos fármacos, el ibuprofeno y el ácido hialurónico (AH), y la eficacia de las formulaciones fue evaluada mediante ensayos in vitro y ex vivo con piel humana. Posteriormente, para tener un conocimiento más profundo acerca de cómo las formulaciones desarrolladas aumentan la liberación de los fármacos, se utilizó el microscopio de fuerza atómica (AFM) y se observaron las estructuras que forman las formulaciones desarrolladas al ser aplicadas en la superficie de la piel humana. Inicialmente, se utilizó fosfatidilcolina (PC) para producir los liposomas y en una segunda etapa de la investigación, se diseñó una composición biomimética con los principales componentes del estrato córneo. En base a esta composición se siguió la estrategia de incorporar los fármacos previamente estudiados, en combinación con los surfactantes seleccionados. La eficacia de las formulaciones fue evaluada y se verificó que la adición de potenciadores de la permeación (PEs) a liposomas, mejora la permeación de AH e ibuprofeno a través de la piel humana. En relación a las imágenes obtenidas mediante el AFM, se observó que la adición de PEs promueve claramente la formación de las estructuras planas, debido a las regiones, parecidas a bicapas o multicapas de lípidos, en coexistencia con liposomas no fusionados y/o intactos observadas. Se estudiaron también las modificaciones de las propiedades elásticas que se producen en las formulaciones desarrolladas al ser aplicadas, lo que permitió correlacionar estas propiedades con la permeación del fármaco incorporado en los liposomas. Por lo tanto, la técnica empleada en el desarrollo del presente trabajo de investigación puede utilizarse como herramienta auxiliar en el desarrollo de sistemas nano vesiculares para administración transdérmica de fármacos.
Theoretical study of ligand migration in Hemeproteins: Truncated Hemoglobin N and Nitrophorin 7
(Universitat de Barcelona, 2013-11-18) Novo de Oliveira, Ana Luísa; Luque Garriga, F. Xavier; Bidon-Chanal Badia, Axel; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El proyecto a desarrollar se centrará en los aspectos dinámicos del transporte de ligandos en hemoproteínas, centrándose en dos tipos principales. Por un lado la hemoglobina truncada N de Mycobacterium tuberculosis, y por otro nitroforina. La hemoglobina truncada N desempeña un papel muy importante como mecanismo de defensa del microorganismo, pues transforma el óxido nítrico (NO) generado por los macrófagos durante las etapas iniciales de respuesta a la infección en anión nitrato. Ello, pues, permite la subsistencia del microorganismo, que permanece en estado de latencia, dificultando la recuperación del paciente de tuberculosis. En consecuencia, dicha proteína aparece como una diana de potencial valor terapéutico, puesto que su inactivación debería reducir significativamente la resistencia del microorganismo. Los estudios del Prof. Luque han perseguido dilucidar los aspectos moleculares que subyacen en la capacidad de la proteína de captar O2 y NO, y de llevar a cabo la reacción química de conversión a nitrato. En particular, se ha propuesto un mecanismo de transporte de ligandos, y el objetivo que se plantea es su validación mediante el examen de diversos mutantes obtenidos al modificar el residuo que controla la migración a través del canal. En cuanto a nitroforina, es una hemoproteína transportadora de NO que se halla en la saliva de insectos cuya alimentación se basa en sangre. Uno de ellos, Rhodnius prolixus, está implicado en la enfermedad de Chagas, que causa un número elevado de muertes (aproximadamente 15000 por año). De entre los diversos tipos de nitroforinas, nuestro interés se centra en nitroforina 7 (NP7), que difiere en el extremo N-terminal respecto a otras nitroforinas. El objetivo del trabajo se centra en determinar el efecto de dichas diferencias sobre la capacidad de captación y transporte de NO. En ambos casos, los proyectos se llevan a cabo en colaboración con grupos experimentales, y confiamos que dicha colaboración permita abrir estrategias de intervención terapéutica.
Exploració computacional de compostos bioactius: reactivitat i interacció lligand-receptor
(Universitat de Barcelona, 2015-07-09) Llabrés Prat, Salomé; Luque Garriga, F. Xavier; Pouplana Solé, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] La present tesis doctoral, presentada com a compendi de publicacions, té com a objectiu general l’estudi de la diversitat en l’espai químic i l’establiment de relacions amb l’espai biològic mitjançant l’ús de tècniques computacionals. Per aconseguir aquest objectiu es van definir dues línies de recerca: l’estudi de noves reaccions multicomponent, i l’estudi de la interacció lligand-receptor per una diana poc comuna i la seva aplicació per al desenvolupament de fàrmacs antigripals. El capítol dedicat a la reactivitat inclou dues publicacions (Preciado S. et al. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51, pp 6874–6877; Llabrés S. et al. Chemistry, a European Journal, 2013, 40, pp 13355– 13361) on es racionalitza el mecanisme d’una nova reacció multicomponent anomenada Mannich Ritter Amidina (MRA). Aquesta es va descobrir mitjançant un canvi d’un reactiu de la reacció multicomponent de Povarov, que va resultar en un producte tetracíclic. Aquest nou producte té una estereoquímica inesperada ja que la unió de dos anells es produeix en syn. Es va dur a terme l’exploració química d’aquesta reacció, la qual va concloure que aquesta reacció MRA només funcionava si s’usaven alguns alquens activats determinats, com ara tipus dihidropirà i ciclohexadiè, i en canvi no en alquens tipus enamides cícliques. A més, quan s’utilitza el ciclohexadiè, la reacció MRA dóna lloc a dues reaccions que entren en competició. L’estudi computacional de explica com la conformació de l’estat de transició és un factor clau en l’estereoselectivitat de la reacció MRA. L’habilitat de deformar la conformació cadira i de bot de l’anell que té caràcter de doble enllaç explica els diferents rendiments de la reacció. El capítol dedicat al disseny d’inhibidors del canal M2 del virus de la grip A inclou dues publicacions (Rey-Carrizo M. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, pp 5738–5747; Rey-Carrizo M. et al. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 96, pp 318–329) i un manuscrit (en preparació) centrats en el desenvolupament de nous compostos inhibidors del canal M2 nadiu i de la seva variant V27A. Els fàrmacs que inhibeixen aquest canal són amantadina i rimantadina, però la FDA no recomana el seu ús perquè l’aparició de soques mutants ha reduït molt la seva eficàcia. El risc d’una possible pandèmia i l’aparició de soques resistents ha promogut un esforç continuat en la recerca de nous fàrmacs antigripals. En col·laboració interdisciplinar entre diversos grups de disseny, síntesi i avaluació farmacològica, en aquest capítol s’ha estudiat el mecanisme d’acció de fàrmacs inhibidors del canal M2 nadiu i del canal mutant V27A, una mutació generada per l’ús dels fàrmacs. El treball computacional s’ha centrat en l’elucidació dels modes d’unió d’aquests compostos en ambdós canals i en les relacions estructura-activitat mitjançant tècniques de dinàmica molecular i càlculs de mecànica quàntica. Per últim, també s’ha explorat el mecanisme d’unió al lloc d’unió del canal mitjançant dinàmica molecular i tècniques de mostreig exhaustiu, com ara la metadinàmica. Aquests estudis han permès identificar dos llocs d’unió en el porus del canal, i caracteritzar el mecanisme d’unió, que afecta la rotació de l’inhibidor a l’interior del canal. Tanmateix, han permès explicar la dràstica disminució d’activitat d’amantadina pel canal mutat V27A.
Asociación de pranoprofeno a sistemas nanoestructurados para administración tópica
(Universitat de Barcelona, 2015-04-10) Abrego Escobar, Guadalupe; García López, María Luisa; Calpena Campmany, Ana Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En el presente trabajo, pranoprofeno (PF) fue asociado a nanopartículas (NPs) poliméricas de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA), preparadas por la técnica de desplazamiento del disolvente. Las PF-NPs fueron optimizadas usando un diseño factorial. Las formulaciones optimizadas fueron aquellas que se prepararon con un pH de la fase acuosa de 4.5 ó 5.5; una concentración de PF de 1.0 ó 1.50 mg/mL; tensoactivo 5 ó 10 mg/mL y PLGA 9.0 ó 9.5 mg/mL. En estas condiciones experimentales, las PF-NPs optimizadas (PF-F1NPs y PF-F2NPs) mostraron un tamaño de partícula apropiado para la administración ocular y/o dérmica (alrededor de 350 nm) y una alta eficiencia de encapsulación del fármaco en el polimero (80%). Para asegurar la estabilidad de las PF-NPs durante un largo período de almacenamiento las formulaciones optimizadas fueron sometidas a un proceso de liofilización. Las características fisicoquímicas de las PF-NPs antes y después de liofilizar fueron similares entre sí. Las interacciones fármaco – polímero fueron evaluadas a través de difracción de rayos X, mediciones espectrales FTIR y análisis de DSC. Los resultados obtenidos sugieren la ausencia de interacciones químicas y confirman que el fármaco se dispersó en el interior de la matriz polimérica. Las PF-NPs optimizadas fueron incorporadas en un hidrogel de Carbómero (HG_PF-F1NPs y HG_PF-F2NPs) o hydrogel en presencia de un 1% ó 3% de azona (HG_PF-F1NPs-Azona y HG_PF-F2NPs-Azona), con la finalidad de obtener formulaciones semisólidas que permitan prologar el tiempo de contacto del fármaco en la superficie ocular y/o dérmica, incrementar la retención del fármaco y aumentar la eficacia analgésica y antiinflamatoria de PF. El análisis morfológico de las PF-NPs incorporadas en el hidrogel mostro que el diámetro de partícula fue similar al observado para las PF-NPs en suspensión. La evaluación del perfil de liberación in vitro de PF reveló que las formulaciones PF-NPs, HG_PF-NPs y HG_PF-NPs-Azona exhiben una liberación sostenida del fármaco comparado con la solución de fármaco libre. Por otra parte, los resultados obtenidos a partir de los ensayos de permeación transcorneal ex vivo y eficacia antiinflamatoria in vivo pone de manifiesto que las formulaciones de HG_PF-NPs-Azona (azona 1% p/p) pueden ser un sistema más efectivo y apropiado en el tratamiento del edema ocular. Adicionalmente, estas formulaciones mostraron una tolerancia ocular óptima por el método HET-CAM y el test de Draize. Los resultados observados a partir de la permeación transdérmica ex vivo y la eficacia antiinflamatoria in vivo de PF sugieren que la aplicación dérmica de la formulación HG_PF-F2NPs puede ser un sistema más apropiado para tratar el edema de la superficie de la piel, respecto al resto de formulaciones ensayadas. Ningún signo de irritación fue detectado tras la aplicación démica de las formulaciones semisólidas de PF en ausencia o en presencia de un 3% de azona.
Interfaces proteína-proteína: un nuevo tipo de diana terapéutica
(Universitat de Barcelona, 2015-02-20) Pujadas Lorente, Montserrat; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En esta tesis se presentan las Interfaces Proteína-Proteína como un Nuevo Tipo de Diana Terapéutica a explotar, a través del estudio de un sistema de dos proteínas implicado en la quimiotaxis bacteriana: CheA/CheY. En la segunda parte de la tesis, presentamos la regulación alostérica por fosforilación en HDAC8, a través de esta proteína poco conocida todavía, queremos vislumbrar el método de propagación que sigue a la entrada del fosfato en el lugar alostérico, y cómo en última instancia esto genera la inhibición de la función desacetilasa de la proteína. Para la primera parte de la tesis, primeramente, se elige un sistema tipo de dos proteínas, en base a un cribado inicial del PDB en busca de cavidades capaces de unir moléculas pequeñas tipo fármaco, que reúnan una serie de características, y posterior caracterización de la cavidad a estudiar. Tras estre cribado, se eligió el sistema CheA/CheY como sistema tipo. Paralelamente, otros miembros del grupo, seleccionaron compuestos comerciales capaces de unirse a la interfaz, mediante programas de docking como rDock, a fin de seleccionar compuestos con posible acción estabilizadora del complejo (compuestos con acción PP-‐glue). Más adelante, también se adquirieron 4 fragmentos derivados de la benzen-‐sulfonamida. La afinidad del complejo y cómo los compuestos le afectaban, fue estudiado: mediante técnicas biofísicas, como SPR y Termoforesis. Mediante la primera técnica, caracterizamos la afinidad del complejo y ensayamos los más de 100 compuestos que se adquirieron, en busca de compuestos activadores, que actuasen como PP-‐ glue. Una vez encontrados, estos se estudiaron más a fondo mediante Termoforesis a fin de saber cuál es la afinidad de cada uno de ellos por cada una de las proteínas del sistema, cómo afecta a la Kd del complejo la adición de estos, y si esta es dependiente de la concentración. Una vez seleccionados los compuestos activadores, se quiso comprobar mediante cristalografía que el luegar de unión de estos era el predicho mediante técnicas computacionales. Para ello, primeramente se obtuvo la estructura cristal del sistema de dos proteínas a 2,5Å. Posteriormente, se buscó obtener la estructura cristal del mismo complejo, esta vez en presencia de los compuestos activadores y fragmentos, mediante co-cristalización y soaks. También realizamos una serie de experimentos in vivo, aprovechando la implicación del sistema en la quimiotaxis bacteriana y que la alteración del mismo puede traducirse en un cambio en la motilidad bacteriana, apreciable macroscópicamente. Para ello, realizamos una batería de cultivos en agar motil, en presencia de atractantes, repelentes, dichos compuestos, y observamos la distancia recorrida en cada uno de los casos. Para la segunda parte de la tesis y el estudio del alosterismo en HDAC8, realizamos una serie de mutaciones estratégicas, determinadas mediante dinámicas moleculares previas, realizadas por miembros del grupo, y observamos mediante Western Blot, cómo afectan estas mutaciones al nivel de fosforilación final de la proteína, y mediante ensayos in vitro observamos su correlación con la actividad desacetilasa final de cada uno de los mutantes.
Protein solvation preferences: applications to drug discovery
(Universitat de Barcelona, 2014-12-18) Álvarez García, Daniel; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa]El diseño de fármacos asistido por ordenador es actualmente un actor fundamental en el proceso de descubrimiento de nuevos fármacos. Las aproximaciones basadas en estructura usan la información estructural de la Diana terapéutica para proponer moléculas activas y seguras. Sin embargo, el proceso dista de ser sencillo y nuevas metodologías están continuamente siendo investigadas para solventar las limitaciones actuales, siendo la flexibilidad de la diana y el tratamiento y la estructura del agua en la cavidad, dos factores usualmente obviados o simplificados. Como ha sido demostrado por varios experimentos de NMR y cristalografía, moléculas pequeñas de solventes orgánicos (p.e. etanol, acetamida o acetonitrilo), son capaces de identificar sitios de unión y proporcionan pistas para el diseño racional de nuevas moléculas bioactivas. MDmix es un método basado en simulación molecular que explota dicho fenómeno in silico. Usando mezclas de moléculas orgánicas pequeñas y agua, cada una con propiedades químicas diferentes, se identifican mapas energéticos de interacción sobre la superficie de la diana. Esta información nos permite identificar sitios de unión para ligandos y caracterizar dicha interacción para guiar el proceso de identificación de hits y la optimización de cabezas de serie. El trabajo presentado en esta tesis se puede dividir en dos publicaciones principales: En la primera, el efecto de la flexibilidad de la diana es estudiado para establecer unas guías de actuación a la hora de simular el sistema. Encontramos que la flexibilidad es fundamental a la hora de identificar cavidades inducidas o con alto grado de flexibilidad pero, a la vez, la interpretación de los resultados es mucho más compleja cuando hay cambios conformacionales. Por otra banda, aplicando restricciones suaves a la movilidad de los átomos, se gana reproducibilidad en los resultados y los errores en la estimación energética son mínimos. En la segunda publicación, se estudió el uso de diferentes mezclas de solventes para la identificación de farmacóforos experimentales en dos sistemas test (heat shock protein 90 y HIV proteasa 1). El tratamiento explícito del agua proporciona mapas energéticos capaces de identificar correctamente los puntos de interacción más favorables con una precisión sin precedentes cuando se compara con otros métodos. Además, demostramos como los mapas energéticos obtenidos para las moléculas de agua son capaces de discernir entre aguas desplazables y no desplazables por un potencial ligando. La información extraída de dichos mapas puede ser de alta utilidad para guiar la identificación de nuevas moléculas activas y para la optimización de la potencia de ligandos ya identificados. Finalmente, se presenta un programa de código abierto escrito en python cuyo objetivo es facilitar el uso de la metodología así como su adopción en cualquier proyecto de diseño de fármacos. En el capítulo final se discuten posibles mejoras y aplicaciones prácticas del método en proyectos actualmente en investigación y direcciones futuras a seguir. MDmix, siendo un método basado en simulación molecular, permite incorporar la flexibilidad de la diana y tratar explícitamente el efecto del solvente. Por ello, ofrece ventajas significativas sobre aproximaciones tradicionales en la identificación de sitios de unión y su caracterización. Siendo aplicable sobre cualquier diana, aún sin conocimiento previo, ofrece una nueva alternativa en el siempre desafiante proceso del diseño de fármacos.
Modelización en diseño de fármacos: Exploración conformacional de ligandos y diseño de inhibidores multipotentes
(Universitat de Barcelona, 2014-12-12) Juárez Jiménez, Jordi; Luque Garriga, F. Xavier; Pouplana Solé, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] La presente Tesis Doctoral, presentada como compendio de publicaciones, tiene como objetivo general la aplicación de diversas técnicas computacionales al estudio de los determinantes moleculares que subyacen en la interacción ligando-receptor. Para ello, se han definido dos líneas de investigación, una de desarrollo metodológico y otra de aplicación. En el capítulo metodológico se incluye un único manuscrito (Juárez-Jiménez et. al., J. Phys. Chem. B, 2014) en el que extiende la metodología Multinivel desarrollada por Forti et. al. (J. Chem. Theory Comput. 2012) al uso de campos de fuerza de mecánica clásica. Dicho estudio es relevante de cara a optimizar la exploración de las preferencias conformacionales de fármacos y otras pequeñas moléculas orgánicas. En concreto, se evalúa el uso de campos de fuerza clásicos para llevar a cabo un muestreo a bajo nivel de teoría de las preferencias conformacionales de moléculas tipo feniletilamina y se comprueba que los resultados obtenidos son consistentes con los datos experimentales descritos en la bibliografia y con los resultados obtenidos con la implementación original del método, donde se empleaba el hamiltoniano semiempírico RM1. En segundo lugar, la nueva implementación del método se utiliza para predecir las preferencias conformacionales del antibiótico estreptomicina, obteniéndose resultados similares a los obtenidos experimentalmente por resonancia magnética nuclear, si bien sugerentes de posibles mejoras en la metodología. El capítulo de aplicación incluye tres publicaciones (Bolea et. al. J. Med. Chem. 2011; Juárez Jiménez et. al. BBA Proteins and Proteomics, 2014 y Viayna et. al. J. Med. Chem. 2014), obtenidas a partir de una colaboración multidisciplinar entre diversos grupos de diseño, síntesis y evaluación farmacológica de compuestos de potencial interés en la enfermedad de Alzheimer. Concretamente, se describe el desarrollo de dos familias de fármacos multipotentes: compuestos iMAO-iAChE y compuestos iBACE-1-iAChE, centrándose la discusión en la elucidación de los modos de unión y las relaciones estructura-actividad de dos series de compuestos multipotentes a sus principales dianas terapéuticas mediante la combinación de técnicas de modelización molecular, tales como el docking y la dinámica molecular. En el primer caso, se describen modelos de unión a AChE y MAO de compuestos híbridos donepezilo-PFN9601, abordándose en detalle los determinantes moleculares de las relaciones estructura-actividad y proponiéndose las causas estructurales del diferente comportamiento cinético observado para el mismo inhibidor en MAO A y en MAO B. Con el fin de mejorar el perfil farmacológico de los inhibidores, también se describe, mediante el empleo de compuestos selectivos MAO A, los determinantes moleculares de la selectividad entre las isoformas A y B que muestran algunos inhibidores de MAO. En el segundo caso, la modelización molecular ha permitido proponer un modo de unión a BACE-1 de compuestos híbridos huprina Y-rheína. Dicho modo de unión, sitúa la unidad de huprina Y en el sitio catalítico, mientras que sugiere que la unidad de rheína quedaría acomodada en un sitio de unión diferente al sitio catalítico, que hasta la fecha no ha sido explorado mediante técnicas de diseño racional de fármacos. Ello abre la puerta al desarrollo de nuevos compuestos que interaccionen con BACE aprovechando dicho centro de unión.
Development of multifunctional polymeric nanoparticles by nano-emulsion templating as advanced nanocarriers targeting the blood-brain barrier
(Universitat de Barcelona, 2015-01-21) Fornaguera Puigvert, Cristina; Solans Marsà, Conxita; Calderó Linnhoff, Gabriela; García Celma, Ma José; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] Les nanopartícules polimèriques multifuncionals (NPs) representen una alternativa prometedora pel tractament de malalties neurodegeneratives, a través de l’administració intravenosa (i.v.), ja que els tractaments actuals provoquen molts efectes secundaris. Les NPs, en canvi, si estan correctament dissenyades, poden actuar específicament en el teixit diana. Ja que l’òrgan diana és el cervell, és necessari un element de vectorització per poder creuar la barrera hemato-encefàlica (BBB). En aquest context, l’objectiu de la present tesi és l’obtenció de NPs com a sistemes avançats d’alliberament de principis actius que travessin la BBB. Es van obtenir NPs a partir de nano-emulsions (NE) plantilla, emprant l’àcid poli-(làctic-co-glicòlic) com a polímer i el mètode d’inversió de fases a temperatura constant per emulsionar, seguit d’evaporació de solvent per obtenir NPs. Les NPs obtingudes tenen mides apropiades per l’administració i.v.. Es va aconseguir encapsular un fluorescent i NPs magnètiques dins les NPs polimèriques, per fer-les servir com a sistemes d’imatge. També es van encapsular fàrmacs per usar-les com a sistemes terapèutics. En tots els casos, es van aconseguir eficiències d’encapsulació molt elevades i un alliberament del fàrmac controlat i prolongat en el temps. A més, es va aconseguir funcionalitzar la superfície de les NPs amb diferents elements. Es van unir covalentment dendrons catiònics per posteriorment unir oligonucleòtids electrostàticament. També es va afegir una coberta exterior de polietilenglicol per protegir el material genètic. Per altra banda, es va funcionalitzar la superfície de les NPs amb un anticòs específic contra el receptor de la transferrina, sobreexpressat a la BBB. A continuació, es van fer assajos in vitro, que van posar de manifest que les NPs no són citotòxiques ni hemolítiques. També es va estudiar l’eficiència de transfecció cel•lular del material genètic, arribant a eficiències de transfecció equivalents a les dels vectors comercials. Assajos in vivo van permetre confirmar el pas a través de la BBB, sobretot de les NPs funcionalitzades amb l’anticòs. Els resultats obtinguts permeten concloure que s’ha aconseguit dissenyar noves NPs polimèriques a partir de NE, apropiades per l’administració i.v. i amb capacitat de travessar la BBB.
Estudis fisicoquímics de diferents seqüències peptídiques del virus de l’Hepatitis G
(Universitat de Barcelona, 2015-01-09) Alay Romero, Maria Teresa; Busquets i Viñas, Ma. Antonia; Prat Aixelà, Josefa; García López, María Luisa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] El contingut de la tesi radica fonamentalment en l’ús de models de membrana biològica per a l’estudi del comportament fisicoquímic de seqüències peptídiques derivades del GB-virus C (GBV-C). La concomitància d’aquest virus amb el virus causant del SIDA (HIV) ha demostrat disminuir notablement la virulència d’aquets darrer. És per això que és important conèixer el comportament de pèptids que són fragments de les proteïnes del GBV-C per a posteriori poder enfocar l’estudi de la inhibició de la capacitat infectiva del HIV per part del GBV-C. Es tracta d’un estudi bàsic però amb resultats que contribueixen al disseny de noves estructures peptídiques per a ser emprades com una nova estratègia per a enfocar el tractament de la SIDA. Finalment indicar que aquest tema s’engloba dins del camp de la nanotecnologia pel que fa a l’ús de liposomes en els distints estudis presentats. Els resultats obtinguts es presenten en les següents publicacions: 1. Alay, M.; Busquets, M.A., Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Prat, J. Merocyanine 540 for spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of hepatitis G virus with liposomes. Luminescence, 17: 263-264 (2002). 2. Alay, M.; Prat, J.; Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of Hepatitis G virus with bilayers. Talanta, 60: 269-277 (2003). 3. Alay, M.; Prat, J.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Effect of merocyanine 540 on Langmuir-Blodgett films and liposomes of zwitterionic, anionic and cationic lipid composition. Journal de Physique IV. 113: 3 -6 (2004) 4. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Analysis of the effect of a peptide sequence of the E2 protein (HGV/GBV-C) on the physicochemical properties of zwitterionic and negatively charged bilayers. Luminescence 20: 445-450 (2005) 5. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of E2 (GBV-C/HGV)-derived peptides with liposomes: fluorescence anisotropy and fluorescence resonance energy transfer methods. Luminescence 21: 360 -361 (2006) 6. Alay, M.; Haro, I., Girona, V.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of two overlapped synthetic peptides from GB virus C with charged mono and bilayers. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces105: 7 -13 (2013)
Estudio biofarmacéutico de flavanonas isoprenílicas antiinflamatorias libres y vehiculizadas en sistemas nanoestructurados para aplicación tópica
(Universitat de Barcelona, 2014-03-24) Domínguez Villegas, Valeri; García López, María Luisa; Calpena Campmany, Ana Cristina; Garduño Ramírez, María Luisa del Carmen; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] Los tratamientos considerados para el dolor y la inflamación han demostrado efectos colaterales, por ello, el descubrimiento e investigación de nuevos fármacos de origen natural son considerados como alternativa favorable. Los flavonoides comprenden un grupo de compuestos del tipo fenólico que abarcan una gran variedad de sustancias dentro de los Productos Naturales. Es por ello que en el presente trabajo se asilaron cuatro flavanonas isoprenílicas: 5, 7-dihidroxi-6-metil-8-prenilflavanona (I), 5, 7-dihidroxi-6-metil-8-prenil-4’-metoxi-flavanona (II), 5, 7-dihidroxi-6-prenilflavanona (III) y 5-hidroxi-7-metoxi-6-prenilflavanona (IV) a partir del extracto metanólico del las hojas de la especie vegetal Eysenhardtia platycarpa. A estas flavanonas se les evaluó su eficacia antiinflamatoria en un modelo de TPA en oreja de ratón, su capacidad antioxidante utilizando DPPH como radical libre y finalmente se hicieron pruebas de citotoxicidad frente a Artemia salina. Posteriormente, se elaboraron nanoformulaciones, en específico nanoemulsiones (NEs) y nanopartículas (NPs) a partir de las cuatro flavanonas Las NPs fueron del tipo polimérico preparadas mediante el método del desplazamiento del disolvente descrito por Fessi utilizando como polímero el PLGA 50/50 a la concentración de 1.5 mg/mL de principio activo. Estas NPs mostraron un tamaño de partícula medio de 156 - 202 nm con una carga negativa entre -25 and -30 mV. Los estudios de microscopía de transmisión electrónica (TEM) evidencian que las NPs tienen forma esférica obteniéndose de esta manera nanoesferas con un patrón denso uniformemente distribuido. Para el caso de las NEs se eleboraron empleando el método de pesada directa a una concentración de 0.5 % de principio activo. Los estudios de TEM y DLS (Dynamic light scattering) indican que se obtuvieron NEs del tipo W/O, de forma esférica y una estructura micelar de las gotas que oscilaban entre 60 y 70 nm; obteniéndose un menor tamaño de gotícula que en el caso de las NPs. A partir de las NPs y NEs se realizaron ensayos de liberación donde se encontró que los compuestos vehiculizados en nanopartículas liberan más rápido que en naoemulsiones; a las 2 h y a las 10 h. respectivamente y en ambos casos, las flavanonas (I) y (III) son las que mayor cantidad de fármaco liberan a esos tiempos. De los ensayos de permeación se observó que la constante de permeación y la cantidad retenida en piel se ven incrementados para las flavanonas (I), (II) y (IV) cuando son vehiculizadas en NPs. Con base a los resultados de la presente investigación se considera que la flavanona 5-hidroxi-7-metoxi-6-prenil flavanona (III) vehiculizada en nanoemulsión y nanopartículas poliméricas presenta los mejores resultados de permeación y actividad antiinflamatoria por lo que puede ser considerado un potencial agente alternativo antiinflamatorio de uso tópico.
Péptidos derivados del GB virus C como potenciales inhibidores del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(Universitat de Barcelona, 2014-01-30) Galatola, Ramona; Haro Villar, Isabel; Gómara Elena, María José; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] En los últimos años, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de nuevos fármacos inhibidores de la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) en la célula huésped. La principal ventaja de este tipo de inhibidores es que actúan como profilácticos, es decir pueden evitar la infección primaria y la integración del genoma viral en el genoma de la célula huésped. Esto implica una reducción del riesgo de sufrir efectos secundarios, y además, se evita el establecimiento y el mantenimiento de reservorios virales latentes. Estudios recientes han demostrado que pacientes coinfectados por los virus GBV-C y HIV-1, tienen una progresión más lenta de la enfermedad del SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) así como una mayor supervivencia. Los estudios realizados, hasta el momento, indican que existe un mecanismo múltiple por el que la infección del GBV-C ejerce un “efecto protector” en los pacientes infectados con HIV-1. Empleando un modelo de co-infección, se ha observado que el virus GBV-C puede inhibir la replicación del HIV-1 así como la entrada de este último en las células. Según los estudios publicados ciertas regiones peptídicas de las glicoproteínas estructurales E1 y E2 del GBV-C presentan un efecto inhibidor frente al virus del HIV-1, y parece ser que interaccionan con el péptido de fusión de la glicoproteína de envoltura gp41 del virus (PF-HIV-1). Teniendo en cuenta dichos resultados, uno de los objetivos de esta tesis doctoral es el diseño y la síntesis de derivados peptídicos pertenecientes a la región (22-39) de la proteína de envoltura E1 del virus GBV-C (E1P8), la cual en estudios previos ha mostrado una cierta actividad inhibitoria del virus del HIV-1. Se pretende mejorar la actividad antiviral del dominio peptídico E1P8 y así abordar el diseño de nuevos péptidos inhibidores de la entrada del virus del HIV-1. Se pretende evaluar el efecto de los diferentes aminoácidos en la estructura primaria de la secuencia nativa, y de su carga neta, en la actividad anti-HIV-1 del péptido E1P8. Con esta finalidad, se ha realizado un “scanning” posicional mediante la síntesis de 23 péptidos lineales, análogos del E1P8, en los que se ha sustituido cada uno de los aminoácidos de la secuencia original por alanina, y cambiado la carga neta del péptido mediante la sustitución de aminoácidos cargados por aminoácidos neutros. A continuación, se ha llevado a cabo el diseño y la síntesis de nuevas formas de presentación peptídica (varios lipopéptidos y un péptido cíclico). El estudio de la interacción entre los derivados peptídicos del E1P8 y el PF-HIV-1 se ha realizado mediante ensayos biofísicos, utilizando modelos de membrana. Para ello, se han utilizado técnicas fluorimétricas, Balanza de Langmuir, Microscopia de fluorescencia, Dicroísmo Circular y Resonancia de Plasmón Superficial. La actividad biológica de los péptidos se ha estudiado utilizando ensayos celulares y ensayos de inhibición de replicación del virus HIV-1. Los resultados obtenidos permiten concluir que tanto la estructura primaria como la carga neta de E1P8 son esenciales para su actividad anti-HIV-1. Los lipopéptidos interaccionan con el PF-HIV-1 e inhiben la infección del HIV-1 con una mayor actividad que la secuencia nativa. El péptido E1P8 ciclado es el que presenta la mejor actividad inhibitoria del virus HIV-1, por lo que podría considerarse como punto de partida para el diseño de péptidos derivados del GBV-C con aplicación en futuras terapias anti-HIV-1.
Investigation of the phospholipid peripheral region of lactose permease in model membranes
(Universitat de Barcelona, 2013-11-07) Suárez Germà, Carme; Borrell Hernández, Jordi; Domènech Cabrera, Òscar; Montero Barrientos, Ma. Teresa; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] La interacció entre una proteïna de membrana i els fosfolípids que l’envolten és crucial pel bon plegament i la correcta funció de la proteïna. Aquesta tesi està centrada en la investigació de la interacció entre la Lactosa permeasa (LacY), un paradigma dels transportadors secundaris situat a la membrana interna d’Escherichia coli, i sistemes models que mimetitzen el seu entorn lipídic. Aquest treball representa una contribució al camp a través de l’estudi de la interacció a dos nivells: (i) la interacció entre LacY i els fosfolípids presents a la regió anular propera a la proteïna ha estat estudiada a través de mesures de FRET entre un mutant de LacY amb un únic triptòfan i diversos fosfolípids marcats i (ii) la interacció entre LacY amb els fosfolípids més llunyans o bulk s’ha investigat a través de làmines de lípid i proteïna sobre un suport, les quals s’han analitzat a partir de diversos modes de microscòpia de força atòmica (topografia, espectroscòpia de força i force-volume). En primer lloc, s’ha validat la preferència de LacY pels fosfolípids en fases fluïdes (Lα). A més, s’ha confirmat una composició lipídica entre la regió anulars i el bulk. Així, els fosfolípids bulk, considerats com a fosfolípids en fase Lα, tenen PG com a principal component, mentre que PE és el major component de la regió anular. Això sembla indicar una selectivitat entre LacY i els fosfolípids anulars. En segon lloc, s’ha descrit que la selectivitat de LacY per fosfolípid determinat a la regió anular està relacionada amb (i) càrrega neutra i (ii) curvatura espontània (C0) negativa. A més, D68 s’ha assenyalat com un aminoàcid important per la selectivitat de la proteïna envers els lípids anulars. Finalment, s’ha descrit una interacció recíproca entre LacY i els lípids bulk. Així, la presencia de la proteïna modifica la topografia i la nanomecànica del sistema lipídic, especialment de la fase Lα, i, alhora, la nanomecànica de la pròpia LacY varia segons la matriu lipídica que l’envolta. En conseqüència, la composició lipídica de la bicapa sembla determinar les forces que governen l’estreta interacció de LacY amb la membrana i, per tant, aquesta composició és decisiva per la correcta inserció i activitat de la proteïna.
Mecanisme antioxidant de compostos antiinflamatoris no esteroïdals (AINE)
(Universitat de Barcelona, 2004-03-30) Ruiz Soriano, Joan; Pouplana Solé, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
S'han estudiat els mecanismes d'inhibició antioxidant, temps dependent i temps independent per la inhibició competitiva de l'enzim ciclooxigenasa, així com la capacitat d'inhibició selectiva dels seus isoenzims COX-1/COX-2 per les famílies d'antiinflamatoris AINE arilacètics, indolacètics, N-arilantranílics, N-arilpropiònics i Arilheterocíclics, també s'ha estudiat el mecanisme antioxidant dels inhibidors duals ciclooxigenasa (COX) i 5-lipoxigenasa (5-LOX) derivats dels fenols i di-tert-butilfenols (BHT). L'estudi d'aquests mecanismes d'inhibició s'ha realitzat utilitzant mètodes indirectes de relació quantitativa estructura-activitat (QSAR) i mètodes directes per tècniques de docking (anclatge) i de molecular modeling (modelatge molecular) dels complexos [inhibidor-COX].En els mètodes indirectes, en una primera etapa s'ha optimitzat la estructura molecular dels inhibidors per mètodes semiempírics MNDO, AM1, PM3 i mètodes ab inito (3-21G) i posteriorment a través de l'anàlisis conformacional dels grups químics que permeten la lliure rotació molecular s'han obtingut les conformacions de mínima energia. S'ha seleccionat la conformació possiblement bioactiva per superposició (fitting) amb el substracte àcid araquidònic. Finalment s'han calculat diferents propietats electròniques,de lipofilia i estèriques per les sèries de derivats en la conformació bioactiva. Com paràmetres electrònics s'han calculat les càrregues electròniques i la densitat electrònica en determinats àtoms i fragments moleculars, també s'ha calculat el moment dipolar "mi", les energies en els orbitals frontera HOMO-LUMO. Per avaluar la lipofilia s'ha calculat el ClogP. També s'ha representat el PEM i els mapes d'interacció GRID per diversos grups químics, així com les propietats de solvatació amb el programa AMSOL.Com a resultat les activitats antiinflamatòries in vivo (disminució del volum de l'edema provocat per injecció de carragenina) i in vitro (IC50 ) per la inhibició de la COX correlacionen quantitativament amb la densitat electrònica "pi" dels anells aromàtics, així com amb el moment dipolar, indicant l'existència d'un primer procés de fixació a l'enzim a través del grup carboxílic i una posterior transferència electrònica entre el segon anell aromàtic i el receptor. Aquesta correlació ha estat corroborada amb la representació dels mapes de PEM, que diferencien a més el mecanisme d'inhibició temps dependent dels temps independent. Així els inhibidors temps dependents: àc. meclofenàmic, indometacina, diclofenac i flurbiprofèn entre altres presenten una distribució del PEM amb forma cònica sobre el primer anell aromàtic i amb el vèrtex localitzat en el grup carboxílic, mentre que els inhibidors temps independents: amfenac, fenclofenac, àc. mefenàmic, àc. flufenàmic, ibuprofèn i naxoprèn entre altres localitzen el PEM en el 1r. i 2n anells aromàtics. Els mètodes directes de docking i molecular modelling també corroboren i diferencien aquests dos mecanismes d'inhibició: els inhibidors temps dependents estabilitzen la presència d'una xarxa de molècules d'aigua que possibilita el tancament del locus de la COX entre els residus Arg120 i Tyr355 afavorint la formació de ponts d'hidrogen entre els residus Glu524-Arg513 i Arg120-Tyr355, fet que explicaria que aquests compostos temps dependents romanguessin més temps en el centre actiu de l'enzim podent establir així unions complementàries amb residus específics (Val523, Tyr385).Respecte al mecanisme antioxidant dels fenols i derivats del BHT s'ha verificant que aquests inhibidors actuarien mitjançant un mecanisme de captació de radicals, en aquest procés de neutralització intervindria el radical fenòxid, els derivats més actius tindrien més facilitat per formar aquest radical, el qual seria més estable que en els derivats pocs actius, així l'antiinflamatòria correlaciona amb l'entalpia de reacció delta-Hr per la formació del radical fenòxid a l'igual que la densitat electrònica en el punt crític de l'enllaç O-H. Les propietats de lipofilia també serien un factor determinant per la inhibició dual dels enzims COX i 5-LOX, tenint els compostos més actius un elevat ClogP, la inhibició de la COX2 humana pels fenols ha estat verificada pels mètodes de docking interaccionant el grup fenòlicamb la Ser530 i l'àrea hidrofòbica es localitzaria en un locus específic de l'enzim. En la inhibició de la 5-LOX seria important la interacció dels inhibidors amb l'àtom de ferro de l'enzim que resultaria reduït de d'estat fèrric a ferròs, fet que explicaria la capacitat d'inhibició dual COX i 5-LOX per aquests derivats. Finalment els dos models d'inhibició han estat validats amb sèries de compostos COX selectius i 5-LOX selectius.
Determinació dels paràmetres estructurals d'una glicoproteina amb activitat de grup sanguini A
(Universitat de Barcelona, 1986-09-01) Estelrich i Latràs, Joan; García Fernández, Serafín; Valls, Oriol; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[cat] L'activitat de grup sanguini A en els eritròcits, quan aquesta ha estat referida a substàncies no lipídiques, s'ha assignat de forma concreta a la glicoforina A, la glicoproteïna més gran present en la membrana, i també a l'anomenada banda 3 la principal proteïna de l'eritròcit. En altres casos l'activitat de grup sanguini ha estat relacionada amb altres glicoproteïnes sense especificar-ne els trets més característics. En base a aixó, l'objectiu de la tesi ha estat la caracterització fisico-química i estructura d'una molècula que químicament tingui naturalesa glicoproteïnica, anant acompanyada aquesta d'activitat de grup sanguini A. Així, a partir de sang de 18 donants sans s'han obtingut les membranes de l'eritròcit per mitjà de la lisi hipotònica. La presència d'activitat acetilcolinesterasa en les membranes indica que les vesícules s'han tancat amb la mateixa orientació que tenien els eritròcits abans de la lisi. Les membranes, un cop homogenitzades, dialitzades i liofilitzades, s'han sotmes al procés de solublització, és a dir, el procés que converteix l'estat complexe de la membrana intacta en un estat més senzill que permeti l'anàlisi dels components de la membrana per mètodes que no poden aplicar-se a la membrana intacta. Després de realitzar un estudi comparatiu amb tres tècniques solubilitzadores, s'ha escollit la fonamentada amb l'extracció dels lípids per la mescla cloroform-metanoI (2:1, v/v). A continuació, les glicoproteïnes es precipiten de la fase aquosa per adició d'etanol (concentración final del 60 %) i manteniment durant 48 h a -20°C en presència de clorur sòdic. Les glicoproteïnes es purifiquen per cromatografia de filtració per gel (Sephadex G-75) i per cromatografia d'afinitat fent passar les glicoproteïnes a través d'un gel que contenia la lectina Helix pomatia (Helix pomatia Lectin - Sepharose 6MB), que específicament uneix les glicoproteïnes que porten com a sucre terminal la N-acetil-D-galactosamina, glúcid característic de les glicoproteïnes amb activitat de grup sanguini A. La glicoproteïna eluïda de la columna per una concentración 0.1 M de N-acetil-D-galactosamina té una capacitat inhibitòria de l'hemaglutinació de 38.82 micrograms/mL, amb una forquilla de 39.43 i 38.21 micrograms/mL, per un Iímlt de confiança alfa=90. L'anàlisi dels aminoàcids i glúcids corresponents ha proporcionat uns percentatges respectius de proteïna i sucres del 41.05 i 58.95. Cal destacar l'alta presència de serina i treonina (aminoàcids que en una glicoproteïna són els que uneixen la cadena glucídica al nucli peptídic), la molt baixa proporció d'aminoàcids cromòfors (triptofan i tirosina), la qual cosa explica que la molècula no presenti una marcada absorció pels voltants dels 280 nm i també justifica el baix valor del coeficiente d'absorció específica (0.4324 L/g. cm). La molècula no conté cisteïna i, per tant, no poden existir enllaços disulfuro intramoleculars. Pel que fa als glúcids, la meitat d'aquestos corresponen a hexosamines, trobant-s'hi també hexoses neutres i àcid siàlic. La valoració de la glicoproteïna pel mètode clàssic de Lowry presenta una gran pèrdua de sensibilitat envers la que el mètode presenta quan hom valora una proteïna estàndard, com és ara el cas de I'albúmina sèrica bovina. Per aixó, s'ha desenvolupat un mètode per a quantificar les glicoproteïnes basat en determinar per espargiment de la llum ("light scattering") la turbidesa produïda per l'adició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode per l'afició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode, a més de precís, no és destructiu. El valor de la masa molecular calculat per a la glicoproteïna ha estat de 53500 ±4280 Da (per light scattering), de 41500 Da (per anàlisi d'aminoàcids) i de 76000 la forma dimèrica i 43000 la monomèrica (per PAGE-SDS). La cromatografia de filtració per gel no és adient per a determinar la masa molecular atès que proporciona valors molt superiors als reals a causa de l'efecte distorsionant de l'àcid siàlic i de la possible capacitat d'autoagregació. Entre les propietats físico-químiques estudiades (absorció a l'espectre U.V., dependència de la turbidesa amb la longitud d'ona, espectroscòpia derivativa, variación de l'espectre d'absorció a l'U.V. en funció del pH, ionització dels grups fenòlics, absorció a l'espectre I.R., dispersió rotatòria òptica (D.R.O.), comportament cromatogràfic, viscositat, punts isoelèctric i isoiònic, volum específic parcial, increment de l'índex de refracció i solubilitat), destaquen aquelles que proporcionen una més gran informació sobre la molècula, cas de la D.R.O. i de la viscositat. L'espectre de D.R.O. de la glicoproteïna presenta una vall negativa de feble magnitud a 234 nm, mentre que els valors de la viscositat intrínseca i de la constant d'Huggins apunten vers una estructura de la molècula en cabdell monoestadístic ("random coil"). A partir de les característiques estructurals determinades s'ha pogut obtenir que la glicoproteïna té una estructura molt expandida (37.70 nm de radi de gir), que presenta un 50 % de cabdell monoestadístic, un 30 % d'alfa-helix i un 20 % de beta-fulla (segons els valors obtinguts entre 220 i 250 nm, aplicant els tractaments de Greenfield et al. i Chen et al.), i que els aminoàcids cromòfors es troben tant en l'interior com en l'exterior de la molècula (estudi de l'acció dels agents pertorbants no polars: urea, d,ioxà i polietilenglicol). Finalment, s'ha estudiat per diferents tècniques l'estabilitat estructural de la glicoproteïna enfront del clorhidrato de guanidina, la urea i la calor. Amb els resultats obtinguts pot arribar-se a la conclussió que la glicoproteïna és molt estable; que, a més, l'acció desnaturalitzant és reversible i que el procés de desnaturalització és complexe, no podent ésser identificat amb un procés en dos estats, natiu i desnaturalitzant, com succeeix en moltes proteïnes.
Protein-ligand binding sites. Identification, characterization and interrelations
(Universitat de Barcelona, 2011-10-14) Schmidtke, Peter; Barril Alonso, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
El trabajo presentado en esta tesis cubre varios campos de investigación relacionados con el desarrollo de moléculas bioactivas. Se compone de cinco partes distintas que se resumen aquí. Predicción de la utilidad farmacológica de dianas terapéuticas. El desarrollo de fármacos está generalmente dirigido a inhibir la función de una proteína específica. Pero para validar esta proteína como diana terapéutica, al principio de un proyecto de descubrimiento de fármacos se tiene que saber si una molécula de tipo fármaco puede unirse con suficiente afinidad a la proteína como para alterar su función. Existen métodos que predicen si una potencial diana terapéutica es tratable o no por vía farmacológica, lo que se ha dado en llamar ‘druggability’. El problema es que estos métodos no están accesibles libremente y su validación es discutible. En la primera parte de la tesis se ha compilado un conjunto extensivo de datos de cavidades en proteínas cuyo novel de ‘druggability’ es conocido, haciéndolo accesible en una plataforma web pública (http://fpocket.sourceforge.net/dcd). Estos datos pueden ser modificados por cualquier persona que quiera contribuir al desarrollo de este conjunto de datos, aumentando su volumen o mejorando su calidad. En estudios previos, los sitios druggable se han asociado a cavidades profundas e hidrofóbicas, ignorando la importancia que tiene los grupos polares en el sitio de unión y su posible relación con la ‘druggability’. Utilizando el set de datos compilado previamente, hemos encontrado que aunque las cavidades ‘druggables’ son mas hidrofóbicas, también tienen grupos polares más expuestos pero con poca superficie de interacción. Esta observación es objeto de posteriores investigaciones en la segunda parte de la tesis. Finalmente, se ha utilizado un algoritmo de búsqueda de sitios de unión, fpocket, que empecé a desarrollar como proyecto de master. Este programa se ha utilizado para extraer todas las características de las cavidades ‘druggables’ y no ‘druggables’ y estos parámetros se han utilizado para entrenar un modelo logístico capaz de predecir si un sitio es druggable o no. Demostramos que el algoritmo y la función de puntuación desarrollado durante esta primera parte predice la ‘druggability’ de manera fiable. Los resultados son de igual calidad a los obtenidos con el único otro programa accesible con funcionalidad parecida (SiteFinder, de Schrödinger), pero nuestro programa tiene las siguientes importantes ventajas: 1) es libre; 2) es mucho más eficiente computacionalmente; y 3) trabaja sobre cavidades detectadas automáticamente por el programa, lo que permite aplicaciones a gran escala. En otras partes de la tesis se verá como su aplicación al conjunto del PDB permite novedosas aplicaciones en el área del diseño de fármacos. Análisis de movilidad de cavidades de las proteínas Existen una gran variedad de algoritmos que permiten identificar posibles sitios de unión en las estructuras tridimensionales de las proteínas. El trabajo presentado en la sección anterior de esta tesis permitía extender uno de estos algoritmos para caracterizar la ‘druggability’ de las cavidades. Un problema de gran calado en el estado actual de la técnica, tanto de detección de sitios de unión como en diseño de fármacos en general,4 es que las proteínas se tratan como un cuerpo rígido a pesar de que en realidad gozan de una gran movilidad estructural. El objetivo de esta sección era otorgar todavía otra funcionalidad a fpocket, el programa de predicción de sitios de unión, para permitir también la detección y el análisis de cavidades de proteínas en movimiento. Habitualmente, los movimientos de las proteína se pueden simular usando la dinámica molecular (MD). Una herramienta capaz de analizar conjuntos de estructuras derivados de MD u otras fuentes puede ser, por tanto, extremadamente útil para observar la aparición de cavidades transitorias y su plasticidad. Como resultado final de este trabajo, se presenta un nuevo programa informático, llamado MDpocket y que se enmarca dentro del paquete fpocket. Para cada conformación de la proteína, se ejecuta un ciclo de detección de cavidades con fpocket. Los resultados de este proceso se plasman sobre una malla tridimensional superpuesta a la estructura de la proteína. La malla puede entonces ser visualizada o analizada en mayor detalle. Lo primero se puede llevar a cabo con programas de visualización molecular tales como PyMOL, VMD o Chimera. Otra funcionalidad dentro de MDpocket es la de seguir la evolución de las propiedades de una cavidad o zona de interés (definida por el usuario) a lo largo del tiempo. Cabe destacar que MDpocket es igualmente capaz de identificar sitios de unión de moléculas tipo fármaco como pequeños canales en la matriz proteica que pueden ser importantes para la migración de pequeños ligandos como gases o moléculas de agua. Las posibles aplicaciones de MDpocket se ejemplifican en tres casos distintos. El primero es la capacidad de identificar la apertura transitoria de cavidades en el sitio de unión de ATP en la proteína HSP90. En el segundo ejemplo, se muestra como MDpocket permite identificar un canal de migración de moléculas biatómicas en mioglobina, un sistema de referencia bien conocido. Aquí se demuestra que MDpocket puede, no tan solo identificar los sitios internos de unión a Xenón, sino también los canales que se abren de forma transitoria para permitir a los ligandos migrar de un sitio a otro. En el último ejemplo, las propiedades del sitio de unión a ATP de la proteína cinasa P38 se analizaron a lo largo de una trayectoria de MD, evaluando la capacidad de MDpocket para identificar aquellas conformaciones que pueden ser particularmente útiles para realizar docking molecular. Uno de los principales problemas en docking de proteína-ligando es que el receptor generalmente se considera rígido, mientras que si se utilizan múltiples conformaciones (cristalográficas o derivadas de MD) para representar al receptor es difícil decidir a priori cuales de ellas pueden dar mejores resultados. Aquí mostramos que MDpocket se puede utilizar para seleccionar conformaciones concretas de una trayectoria de MD para usarlas en procesos de docking. Concretamente, hemos observado que la densidad hidrofóbica promedio (previamente identificada como un descriptor importante para predecir ‘druggability’) correlaciona bien con la probabilidad de que el modo de unión de ligandos pueda ser predicho correctamente. Tal como en el trabajo anterior, MDpocket se incluye dentro del proyecto fpocket y se está accesible como una herramienta libre y de código abierto. Relaciones estructura-cinética de unión El control de los tiempos en interacciones moleculares es una propiedad esencial de los sistemas bioquímicos, pero poco se conoce sobre los factores estructurales que gobiernan la cinética de los procesos de reconocimiento molecular. Partiendo de una observación realizada durante el trabajo de predicción de ‘druggability’, aquí se ha investigado el papel que átomos con poca superficie expuesta a solvente pueden jugar en los sitios de unión de la proteína. En particular, encontramos que los átomos polares en los sitios druggable son minoritarios en comparación con los átomos apolares, pero si bien pueden tener poca superficie accesible, tienden a ser mas protuberantes, lo que los hace más accesibles para establecer interacciones. Hemos establecido que esta propiedad puede estar relacionada con la cinética de unión/disociación de un ligando a su cavidad en el receptor. En diseño de fármacos, la vida media del complejo formado entre el fármaco y su diana terapéutica determina en gran medida sus efectos biológicos, pero en ausencia de relaciones estructura cinética, se hace imposible optimizar esta propiedad de forma racional. Aquí se muestra que átomos polares prácticamente enterrados (ABPAs) – un elemento comúnmente encontrado en los sitios de unión de proteínas – tienden a formar puentes de hidrógeno que están protegidos de las moléculas de agua. La formación y ruptura de este tipo de puentes de hidrógeno implica un estado de transición penalizado energéticamente porque ocurre de modo asincrónico con el proceso de deshidratación/rehidratación. En consecuencia, los puentes de hidrógeno protegidos se intercambian a velocidades lentas. Estas conclusiones se basan en el estudio computacional del proceso de unión de un pequeño ligando a un sitio de unión modelo. El receptor modelo se construyó para permitir modular tanto el grado de exposición del átomo polar como la curvatura del entorno apolar. Mediante el uso de dinámicas moleculares con constricciones y la relación de Jarzinsky, se obtuvieron los perfiles de energía libre de unión para cada cavidad. La presencia de un estado de transición (y por tanto menor velocidad de asociación/disociación) puede anticiparse mediante un simple análisis estructural tal como la medición de la superficie accesible del átomo polar o su grado de protrusión. Esto constituye una nueva y valiosa clave para interpretar y predecir relaciones estructura-actividad, que se ha puesto a prueba investigando sistemas reales. En primer lugar, analizando tanto estructuras cristalográficas depositadas en el PDB como trayectorias de dinámica molecular, se ha demostrado que aquellas moléculas de agua que forman puentes de hidrógeno con ABPAs tienden a tener menor movilidad e intercambios más lentos. Posteriormente, la validez del principio se ha demostrado en dos pares de inhibidores de la proteína Hsp90, una diana terapéutica para cáncer, para los que se han obtenido datos estructurales, termodinámicos y cinéticos mediante distintas técnicas experimentales. El acuerdo entre observables macroscópicas y los resultados de simulaciones moleculares confirma la función de los puentes de hidrógeno protegidos de solvente como trampas cinéticas e ilustra como nuestro hallazgo puede ser usado para facilitar el proceso de diseño de fármacos basado en estructura. Base de datos de cavidades: hacia el ‘pocketoma’ El trabajo presentado en el principio de la tesis perseguía un objetivo muy especifico, que se enmarca en un proyecto mayor del grupo de investigación. La herramienta de predicción de ‘druggability’ se desarrolló con el fin de cribar grandes bases de datos estructurales, tales como el PDB, identificando complejos proteína-proteína no obligados (transitorios) que contengan en su interfase una cavidad potencialmente capaz de unir moléculas de tipo fármaco. Con ello se pretende estabilizar selectivamente dicha interacción y conseguir un efecto biológico que pueda ser terapéutico. Dado que la información sobre cavidades y su druggability asociada va a ser explotadas por otras personas en el grupo en este y otro tipo de proyectos encaminados a facilitar la explotación de nuevos mecanismos de acción, es necesario crear una base de datos que contenga esta información y sea fácilmente navegable. Para empezar, se ejecutó el programa para cada una de las estructuras depositadas en el PDB, identificando todas las cavidades y extrayendo sus descriptores, entre los que se incluye la función de puntuación de druggability. Esta información se guarda de forma organizada en una base de datos relacional (pocketDB), que se relaciona con otras bases de datos tales como Uniprot y Uniref, que contienen información sobre secuencias. Igualmente, se incluyeron información sobre la estructura cuaternaria y otros recursos tales como Kegg, haciendo de pocketDB un potente recurso para filtrar de modo eficiente millones de cavidades, identificando aquellas que tengan mayor interés para cada proyecto. De modo particular, cabe destacar la aplicación de pocketDB a la identificación de cavidades ‘druggable’ situadas en la interfase de complejos transitorios proteína-proteína, resultando en 39 complejos candidatos, entre los que se recobraron 3 casos conocidos previamente, lo que valida la metodología. Además otros tres sistemas identificados, después de una inspección minuciosa, han sido seleccionados en el grupo como candidatos para realizar la prueba de concepto que valide esta nueva estrategia farmacológica. Uno de ellos está actualmente en fase de validación experimental. El ‘pocketoma’ La última sección de mi tesis presenta un proyecto que hace un uso extensivo de la base de datos de cavidades (pocketDB) previamente presentada. Dos cuestiones importantes aún persisten hoy día en el proceso de descubrimiento de fármacos y, de algún modo, contribuyen a la alta tasa de fracasos en las fases tardías del desarrollo, que normalmente se explican por la baja eficacia o el exceso de efectos secundarios (normalmente tóxicos) para el organismo. Ambas situaciones pueden ser explicadas por un fenómeno común: la falta de selectividad. Las fármacos interaccionan en la célula con una diversa variedad de macromoléculas además de con la diana terapéutica, induciendo así efectos secundarios imprevistos. Asimismo, considerar solamente una diana para nuestro fármaco puede resultar menos efectivo de lo esperado, puesto que la pérdida de función de una sola proteína diana puede ser fácilmente reemplazada debido a los mecanismos homeostáticos controlados por robustas redes de interacciones, derivando en una pérdida de eficacia de nuestra molécula. Este trabajo pretende sentar las bases para poder establecer relaciones entre macromoléculas biológicas en base a su potencial para interaccionar con una misma entidad química (fármaco). El trabajo se basa en la asunción de que cavidades similares son capaces de unir ligandos similares. Existen varios métodos que calculan la similitud entre cavidades de unión, sin embargo, hasta la fecha no se ha realizado un análisis relacional profundo de todas las cavidades en el PDB que permita establecer relaciones entre ellos. Con el fin de cumplir con los requerimientos técnicos de unos objetivos tan ambiciosos, se ha desarrollado un novedoso método de comparación de cavidades. En este particular método se considera una representación muy abstracta de la cavidad. Dicha representación reúne información tanto sobre la forma de la cavidad cómo sobre la distribución por pares de los puntos de interacción en la superficie. No obstante, la información sobre la topología exacta de la cavidad es ignorada. Tal abstracción intenta relacionar cavidades que estructuralmente están alejadas, pero que se parecen entre ellas en términos de forma y propiedades fisicoquímicas globales. Usando varios ejemplos de validación en un conjunto de cavidades de referencia, el método resulta capaz de recuperar de un gran set de cavidades aquellas más similares y relacionadas entre sí. Del mismo modo, el método demuestra ser útil para encontrar relaciones entre cavidades previamente no relacionadas y que sin embargo unen los mismos ligandos o moléculas muy similares. Esta nueva implementación se ha utilizado en un experimento de exploración a gran escala para encontrar (i) las mismas cavidades en diferentes estructuras, (ii) cavidades relacionadas y (iii) cavidades con la misma estructura de ligando. Se obtuvieron excelentes resultados para estas tres categorías. Seguidamente, se compararon entre ellas todas las cavidades encontradas en el PDB. Se desarrolló una herramienta computacional novedosa para permitir la navegación en el 'pocketoma' resultante de las comparaciones, que será posible descargar gratuitamente. Los resultados presentados muestran por primera vez un espacio global interrelacionando cavidad-ligando para todas las cavidades del PDB. Finalmente, se señalan a continuación dos aplicaciones que ponen de manifiesto el posible impacto del ‘pocketoma’ y la herramienta de navegación. En el primer ejemplo, una cavidad no caracterizada encontrada en GSK3-β fue comparada contra todas las cavidades del PDB, permitiendo obtener una variedad de cavidades, y sistemas, supuestamente relacionadas. Entre los resultados se encontraban las subunidades de unión a ADP dhaL y dhaM de la PTS dependiente di-hidroacetona cinasa. Se encontró que el sitio de unión a ADP era muy similar a la cavidad investigada en GSK3-β con una sorprendente similitud estructural entre ambos. En el último ejemplo, se navegó por el ‘pocketoma’ utilizando la herramienta visual desarrollada para tal tarea. Durante la exploración se encontró una curiosa e importante relación entre el sitio de unión de la hormona del receptor de estrógenos y una cavidad no caracterizada en la proteína Caspasa-3. Seguidamente, se realizó un estudio de docking con ligandos similares a la hormona y se procedió a realizar una extensiva dinámica molecular con el ligando en la mejor posición para verificar la estabilidad del compuesto en la cavidad de Caspasa-3. El complejo proteína-ligando estudiado resultó ser muy estable. Actualmente, el compuesto identificado se encuentra bajo validación experimental por nuestros colaboradores.
Estudios biofísicos de péptidos sintéticos de la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV y su relación con el VIH
(Universitat de Barcelona, 2011-07-04) Sánchez Martín, Ma. Jesús; Alsina Esteller, Ma. Asunción; Haro Villar, Isabel; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El virus C (GBV-C) o virus de la hepatitis G (HGV) está relacionado con el virus de la hepatitis C (HCV) ya que tiene una organización genómica y una homología en la secuencia muy próxima pero, sin embargo, no parece causar hepatitis ni ningún otro tipo de patología. En los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se asocia la co-infección del GBV-C/HGV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con una menor progresión de la enfermedad causada por el virus VIH así como con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el SIDA se ha desarrollado. Basándonos en un modelo de co-infección, existen diversas teorías de cómo el virus de la hepatitis G puede influir en la enfermedad del VIH, se cree que puede inducir las quemoquinas, regular negativamente los co-receptores del VIH, así como provocar otros efectos indefinidos en los linfocitos huésped. Pero el mecanismo responsable del efecto beneficioso que el GBV-C/HGV tiene sobre el curso de la infección causada por VIH no está todavía definido. Teniendo en cuenta el posible uso de los péptidos sintéticos, el objetivo de la actual tesis doctoral es llevar a cabo la selección de péptidos de la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV con potencial capacidad de inhibición del péptido de fusión del VIH-1, mediante la síntesis múltiple en paralelo de secuencias peptídicas lineales que cubren la totalidad de la estructura primaria de esta proteína y su posterior evaluación mediante ensayos biofísicos. Con ello se pretende plantear la utilización de péptidos sintéticos del GBV-C/HGV en el diseño de inhibidores de la entrada del VIH en la célula huésped. Se pretende así tratar de comprender mejor el efecto de la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en la progresión de la enfermedad causada por la infección del VIH y de profundizar en el conocimiento actual acerca de la interacción entre estos dos virus. Se realiza la síntesis en fase sólida de 58 péptidos correspondientes a la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV y mediante el ensayo de liberación de contenidos vesiculares se seleccionan 5 péptidos capaces de inhibir la capacidad del péptido de fusión (PF) del VIH-1 de formar poros en las membranas. Se realizan estudios detallados de los péptidos y de la inhibición del proceso de fusión, inducido por el péptido de fusión del VIH-1, por parte de secuencias del GBV-C/HGV. Para ello se realizan estudios de citotoxicidad, ensayos de hemólisis, estudio de la estructura mediante dicroísmo circular, ensayos de agregación de liposomas inducida por los péptidos y ensayos de transferencia de energía por resonancia. Por otra parte se realizan ensayos utilizando monocapas de extensión como modelos de membrana mediante la técnica de Langmuir-Blodgett, y se calculan las concentraciones superficial de exceso y las de saturación, información que servirá para conocer la capacidad de los péptidos para formar monocapas estables en la interfase aire/agua. Los diferentes ensayos muestran una interacción de los péptidos de la proteína E1 con el péptido de fusión del VIH-1, dando lugar a una inhibición de la actividad que el péptido de fusión del VIH-1 tiene sobre las membranas lipídicas. Esto sugiere que estos péptidos pueden ser candidatos para ser utilizados en futuras terapias antivirales.
Diseño y síntesis de péptidos para el diagnóstico de la infección por el virus de la hepatitis G (GBV-C/HGV)
(Universitat de Barcelona, 2007-05-30) Pérez Escoda, María Teresa; Ercilla González, M. Guadalupe; Haro Villar, Isabel; Muñoz Juncosa, Montserrat; Universitat de Barcelona. Departament de Físicoquímica
[spa] El virus de la hepatitis G (GBV-C/HGV) es un virus ARN perteneciente a la familia Flaviviridae. Su prevalencia, basada en la positividad del ARN, oscila entre el 1 y el 4% en la población general. Sin embargo este porcentaje aumenta hasta el 20-30% en los individuos expuestos a sangre o sus derivados, en individuos infectados por el virus de la hepatitis C o por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), hecho que indica que se transmite principalmente por vía parenteral. Aunque no está claro su potencial patogénico, los estudios más recientes sugieren que la infección por este virus reduce la mortalidad en los pacientes infectados por el HIV, de ahí el interés en disponer de una herramienta que permita el diagnóstico de la infección por GBV-C/HGV de un modo rápido y sencillo. Desde hace años, los péptidos sintéticos se vienen utilizando en sistemas de diagnóstico para muchas enfermedades, sin embargo, los péptidos lineales que mimetizan epítopos B son débilmente reconocidos por los anticuerpos, y por ello, existe la tendencia de utilizar combinaciones más complejas que permitan mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad de los ensayos. En esta tesis se han diseñado y sintetizado, utilizando la metodología de síntesis en fase sólida, construcciones peptídicas en las que se combinan regiones de proteínas de envoltura y no estructurales. Se han sintetizado tanto péptidos quiméricos, que contienen más de un epítopo (lineales y ramificados), como péptidos cíclicos en los que los epítopos sufren restricción de movilidad. La capacidad antigénica de las construcciones sintéticas se ha evaluado utilizando principalmente la técnica del enzimoinmunoensayo (ELISA) aunque también se ha investigado la utilidad de la técnica de la resonancia del plasmón de superficie (SPR) para detectar la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en muestras de suero de individuos pertenecientes tanto a los grupos de riesgo como en la población sana. Además, se ha realizado un estudio conformacional con la finalidad de establecer una correlación entre la estructura secundaria adoptada por los péptidos y su capacidad antigénica. Finalmente, se ha estudiado la capacidad inmunogénica de las construcciones peptídicas en animales de experimentación. Los resultados obtenidos muestran, por un lado, que las construcciones en las que se combinan varios epítopos son las que presentan una mejor precisión diagnóstica, y por otro lado, que la introducción de restricción de movilidad permite incrementar la sensibilidad mostrada por la molécula precursora lineal.

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