Syntheses and applications of 3-bromo-1,2,4,5-tetrazines as novel tools for chemical biology

Abstract

[eng] The present doctoral thesis has been devoted to the use of 1,2,4,5-tetrazines as potential tools for chemical biology. Tetrazines have become extremely interesting functionalities due to their ability to undergo fast inverse electron-demand Diels- Alder (iEDDA) cycloadditions in vivo. Therefore, the use of tetrazines in bioorthogonal reactions, which are reactions that can take place under biocompatible conditions, is having a major impact in the development of new research tools and novel therapeutic strategies. Initially, the synthesis of different 3-bromotetrazines with unprecedented yields is described, in a metal- and oxidant-free synthetic route. These 3-bromotetrazines have been used to attain late-stage functionalisation of small molecules, through either nucleophilic aromatic substitutions or Palladium-mediated cross-coupling reactions. Both the in vivo stability and kinetics in the iEDDA cycloaddition of the formed products have been studied, as they are critical factors when aiming for a bioorthogonal applicability. Of note, the spectroscopic characterisation of the generated tetrazine ethers has been performed due to their fluorescent behaviour. Next, the monosubstituted 3-bromo-1,2,4,5-tetrazine has been used to chemoselectively label proteins in solution through their natural lysine residues. The formed 3-aminotetrazines in the protein surface are able to trigger click-to-release reactions with trans-cyclooctene carbamates. This reaction has been exploited to activate prodrugs in vivo, opening the way for potential targeted drug delivery therapies. Finally, the site-selective incorporation of tetrazinyl-containing unnatural amino acids directly into proteins of choice is described. To that end, the manipulation of the translation machinery of the target organisms is required through an orthogonal translation system capable of recognising the desired amino acids without compromising cellular fitness, thereby successfully expanding the genetic code artificially. We have shown the incorporation of a new amino acid capable of undergoing click-to-release reactions in E. coli, and we have described the progress made towards such incorporation in mammalian cells through the development of a directed evolution assay.

[cat] Aquesta tesi doctoral s’ha basat en la utilització de les 1,2,4,5-tetrazines com a eines potencials en química biològica. Les tetrazines han esdevingut unes funcionalitats químiques extremadament interessants degut a la seva capacitat de dur a terme cicloaddicions de Diels-Alder de demanada electrònica inversa (iEDDA) in vivo. Per tant, l’ús de les tetrazines en reaccions bioortogonals, és a dir, reaccions que poden tenir lloc en condicions biocompatibles, està tenint un gran impacte en el desenvolupament de noves eines per a investigació i d’estratègies terapèutiques innovadores. Inicialment es descriu la síntesi de diferents 3-bromotetrazines amb rendiments sense precedents, a través d’una ruta sintètica que no requereix ni metalls ni oxidants. Aquestes 3-bromotetrazines s’han utilitzat per aconseguir la funcionalització de molècules petites en última etapa, mitjançant substitucions nucleòfiles aromàtiques or reaccions d’acoblament catalitzades per Pal·ladi. Tant l’estabilitat in vivo com els paràmetres cinètics de la cicloaddició iEDDA dels productes formats s’han estudiat, ja que són factors crítics que en determinen la seva aplicabilitat en reaccions bioortogonals. Cal destacar que la caracterització espectroscòpica de les tetrazines generades s’ha dut a terme degut al seu comportament fluorescent. Seguidament, el compost monosubstituït 3-bromo-1,2,4,5-tetrazina s’ha utilitzat per funcionalitzar quimioselectivament proteïnes en solució a través de les seves lisines naturals. Les 3-aminotetrazines formades a la superfície de la proteïna són capaces de dur a terme reaccions d’alliberament a través de click amb carbamats de trans-ciclooctens. La reacció s’ha utilitzat per activar profàrmacs in vivo, obrint la porta per al desenvolupament de teràpies d’alliberament de fàrmacs dirigides. Finalment, es descriu la incorporació lloc-específica d’aminoàcids funcionalitzats amb tetrazines directament en posicions de proteïnes escollides. Amb aquesta finalitat, es requereix la manipulació de la maquinària de traducció de certs organismes a través d’un sistema de traducció ortogonal capaç de reconèixer els aminoàcids desitjats sense comprometre la viabilitat cel·lular, aconseguint així l’expansió del codi genètic artificialment. Aquí mostrem la incorporació de nous aminoàcids capaços de dur a terme reaccions d’activació bioortogonals en E. coli, i també descrivim el progrés realitzat cap a la consecució d’aquesta incorporació en cèl·lules de mamífer a través del desenvolupament d’assajos d’evolució dirigida.