Tesis Doctorals - Departament - Fonaments Clínics
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- TesiNon-Traditional Strategies To Fight Antimicrobial Resistance in Gram-Negative Bacteria: From Cyclic Peptides To Antibacterial Plasmids(Universitat de Barcelona, 2025-07-07) Rosón Calero, Natalia; Masana Nadal, Mercè; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[eng] With the aging population, the rising burden of neurodegenerative diseases presents a critical public health issue, potentially resulting in an unsustainable social and economic burden if current trends continue. Strikingly, most of these diseases lack a cure or even and effective treatment that improves the quality of life for affected individuals. A hallmark of neurodegenerative disorders is synaptic dysfunction, which arises despite neuronal loss and is driven by the accumulation of misfolded proteins, all leading to molecular, circuitry, and functional impairments (Palop & Mucke, 2016). Yet, the exact mechanisms driving these specific alterations are still not fully understood. This highlights the need for a deeper understanding of these diseases and, more importantly, the urgent need for novel therapeutic strategies, potentially based on modulating brain plasticity. In the context of this thesis, we focused in two neurodegenerative diseases, Huntington’s Disease (HD) and Alzheimer’s Disease (AD). HD is an autosomal-dominant, genetic, neurodegenerative disorder characterised by progressive degeneration of striatal and cortical regions of the brain (Huntington, 2003; Walker, 2007). The disease manifests with motor deficits such as chorea, dystonia, and incoordination, alongside cognitive decline and psychiatric impairments. HD is caused by a mutation in the huntingtin (HTT) gene, with an expanded CAG trinucleotide repeat resulting in a mutant form of huntingtin (mHTT) that leads to neurodegeneration (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993a). HD is marked by selective neuronal loss and impaired synaptic plasticity, particularly in the cortex and striatum, with medium spiny neurons being especially vulnerable (Vonsattel & DiFiglia, 1998). Disruption of the cortico-striatal pathway, which plays a critical role in motor and cognitive functions, contributes to the disease’s symptoms (Cepeda et al., 2007).AD, on the other hand, is the leading cause of dementia, characterised by progressive memory decline and impairments in language, executive function, and visuospatial skills (Scheltens et al., 2021; Stelzmann et al., 1995). AD is classified into familial, caused by mutations in genes like APP, PSEN1, and PSEN1 with earlier onset accounting for less than 0.5% of cases, and sporadic AD, present in 99,5% of cases and influenced by genetic, environmental, and lifestyle factors (Bateman et al., 2011; Bertram et al., 2010). AD is characterised by amyloid plaques, tau tangles, and neuroinflammation. Synaptic dysfunction, particularly in the hippocampus, correlates strongly with cognitive decline in AD (Querfurth & LaFerla, 2010). Therefore, synaptic plasticity is an early alteration in both diseases, underscoring the need to develop therapeutic strategies that specifically target these early changes. Synaptic plasticity is the mechanism by which synaptic connections in the brain are strengthened or weakened in response to various stimuli. Impairments in this process are one of the main characteristics in HD and AD, contributing significantly to the functional deficits observed in these conditions (J. Y. Li et al., 2003; Selkoe, 2002). In long term synaptic plasticity, activation of receptors by neurotransmitters triggers signalling pathways that enhance synaptic strength, usually associated to calcium influx. A key component of this strengthening is the insertion of new receptors into the postsynaptic membrane, a process that requires protein kinases and local protein synthesis. Besides calcium, another key signalling molecule sustaining plasticity is cyclic adenosine monophosphate (cAMP). cAMP is modulated by metabotropic receptor activity, and among diverse targets, activates protein kinase A (PKA), which phosphorylates transcription factors like CREB, initiating gene expression required for long-term synaptic modifications (Benito & Barco, 2010). Furthermore, the cAMP-PKA pathway is essential for establishing structural changes in synapses, and its activation has been linked to enhanced synaptic plasticity in various brain regions (C. C. Huang & Hsu, 2006; Nguyen & Kandel, 1997). Additionally, astrocytes also contribute to synaptic plasticity. However, the mechanisms underlying cAMP contribution to synaptic plasticity are not yet completely understood, neither its specific role in neurons or astrocytes. Indeed, alterations in cAMP signalling are increasingly linked to aging and neurodegenerative diseases such as HD and AD (Kelly, 2018). Both the cortico-striatal pathway in HD and the hippocampus in AD show disruptions in the cAMP-PKA signalling pathway. In HD, decreased cAMP signalling in the cortex and striatum and increased in the hippocampus have been reported, although with controversies around it. In AD, it is more well-established that cAMP signalling is decreased in the hippocampus, playing a key role in the development of the dementia-related pathology. Due to the still controversial knowledge of cAMP in HD, and the known importance of the cortex in the disease, our first objective is to characterise the disruptions in cortical cAMP signalling and behaviour in the R6/1 mouse model for the disease. Therefore, approaches aimed at enhancing synaptic plasticity through cAMP signalling modulation hold potential for mitigating or delaying network dysfunction associated with neurodegenerative disorders such as HD and AD. In this regard, optogenetic tools provide precise control of biological mechanisms through light-sensitive proteins. Particularly, photoactivated adenylyl cyclases (PACs) are enzymes that elevate cAMP levels in response to light stimulation, initiated by an AC domain coupled to a photoreceptor module (Iseki & Park, 2021). Among these, DdPAC is a recently optimised PAC that regulates cAMP in response to red light (Stüven et al., 2018). Originally developed in bacteria, DdPAC demonstrated a stronger light response compared to other red-light-sensitive PACs. However, its application in brain cells and in vivo remains unexplored. Considering red light's ability to penetrate tissues with minimal scattering, it is well-suited for non-invasive applications. Given the promising potential of DdPAC as a novel optogenetic tool for modulating cAMP, our second objective is to establish its use for non-invasive modulation of synaptic plasticity in vivo. Further, considering the distinct regional vulnerabilities and pathophysiological differences between HD and AD, which may impact cAMP modulation and synaptic plasticity, our third objective is to restore physiological function through light-driven DdPAC stimulation in mouse models of both diseases. Importantly, the focus will be set on the regions most affected in each condition, specifically targeting the striatum and cortex in HD, and hippocampus in AD. In light of this information, the main aim of this thesis is to restore physiological function in neurodegenerative diseases by modulating brain plasticity through light-induced activation of DdPAC-mediated cAMP signalling in specific brain circuits. To achieve our first objective and characterise the disruptions in cortical cAMP signalling and behaviour in the R6/1 mouse model of Huntington’s Disease, we first assessed cortical cAMP alterations during cortico-striatal behaviours in R6/1 mice. To investigate cAMP dynamics, we performed fibre photometry recordings of the GFlamp-1 sensor, a novel cAMP sensor, in M2 cortical neurons of 14-week-old and 20-week-old WT and R6/1 male and female mice during the beetle-mania (BMT) and accelerating rotarod (ARR) tasks. First, we evaluated cAMP dynamics during the BMT and observed an increase of cAMP levels in both WT and R6/1 mice upon the introduction of the beetle. Despite R6/1 mice already exhibiting altered behaviour during the test, no genotype differences in cAMP levels were detected. These data revealed the involvement of neuronal cAMP signalling during the BMT, with minimal alterations in R6/1 mice. Then, to further understand the contribution of cAMP signalling to M2-cortex related tasks, we explored cAMP dynamics during the ARR. Our results were in line with what we observed during the BMT, as both neuronal cAMP levels from WT and R6/1 mice increased with the start of the task. In contrast of our BMT results, in this case we observed an aberrant overactivation of the M2-cortex in R6/1 mice. Lastly, to better understand if alterations in cAMP activity during M2-cortex related tasks are more prominent at later stages of disease progression, we repeated the BMT in the same cohort of mice at 20 weeks, when mice are fully symptomatic. At this age, we were still able to observe an increase in neuronal cAMP in both WT and R6/1 mice upon the introduction of the beetle. However, the increase in cAMP was significantly diminished in R6/1 mice. Altogether, these results highlight the contribution of neuronal cAMP in M2-cortex related task and display alterations in HD. Due to the critical role of M2-cortex in HD pathophysiology, we also aimed to determine if additional symptoms associated with cortico-striatal dysfunction emerge at early disease stages of the disease in the R6/1 mouse model. To accomplish this, we selected two behavioural tests, namely the adhesive removal test and the marble-burying test, both related with the M2-cortex and the cortico-striatal pathway, and then performed them longitudinally from 4 to 16-week-old mice. In the removal adhesive test, which is related to the M2-cortex-somatosensory cortex-striatum pathway, we observed fine motor deficits as early as 8 weeks, while somatosensory deficits appeared at 16 weeks. In the marble burying test, which is related to the M2-cortex-orbitofrontal cortex-striatum pathway, we observed anhedonia-like behaviour from 8 weeks. These data indicated that cortico-striatal dysfunction emerges at very early timepoints, highlighting the potential for early therapeutic interventions. Overall, findings from the first objective indicate that M2 cortex-related cortico-striatal dysfunction emerges at early disease stages, underscoring the potential for early therapeutic interventions. Since neuronal cAMP signalling is remains responsive in behaving mice, it it is unlikely to underlie the M2-related behavioural deficits, suggesting that alternative mechanisms may be responsible for these impairments. To accomplish our second objective and implement DdPAC as a novel optogenetic tool to non-invasively modulate synaptic plasticity through cAMP signalling, we first aimed to establish a minimally or non-invasive method for the delivery of DdPAC in the brain by using AAVs constructs. Thus, we designed GFP constructs under three different promoters (CAG, CamKIIa, and FLEXon), and administered them using two different AAV serotypes (AAV9 and PHP.eB), into two different mouse strains (C57BL/6J and B6CBA), and via three delivery routes, from more to less invasive (intra-cranial, retro-orbital, and intranasal). In summary, GFP expression was detected in various brain regions and specific cell types following retro-orbital injection of PHP.eB and AAV9 constructs, with the PHP.eB serotype exhibiting broader infection. Furthermore, we were able to express PHP.eB constructs in C57BL/6J and B6CBA mouse strains, and specifically to our R6/1 mouse model. Retro-orbital injection in A2a Cre mice resulted in region-specific transduction of the virus, demonstrating its potential to target specific circuits. Nevertheless, GFP fluorescence was not observed in any of the cases after intranasal administration. These results highlight retro-orbital injection as a minimally invasive approach for efficiently targeting brain regions across various cell types and mouse strains, offering an alternative to stereotaxic surgery. However, additional research on viral capsid modifications is required to facilitate neural cell infection through intranasal administration. To continue with our objective, we next characterised the cell-type-specific DdPAC stimulation effects in the brain. Accordingly, we first aimed to investigate if DdPAC-mediated cAMP modulation was able to enhance synaptic plasticity. Therefore, we injected DdPAC under the CamKIIa or GFAP promoters into the cortex to selectively express it in neurons and astrocytes, followed by multi-electrode array recordings. Red-light illumination enhanced neuronal potentiation in both neuronal and astrocytic-driven DdPAC activation, though the effect was more pronounced when DdPAC was activated in astrocytes. Thus, the following experiments of this objective were focused on investigating DdPAC activation in cortical astrocytes. Thereby, we further characterised the mechanism underlying this potentiation, demonstrating that DdPAC-mediated cAMP increase is PKA- and NMDAR-dependent, but calcium-independent, requires synaptic activity, and induces glutamate gliotransmission. To gain deeper insights into the in vivo effects of astrocytic DdPAC activation, we performed phospho-proteomics and proteomics analyses. Our omics data validated the involvement of the cAMP-PKA signalling pathway in astrocytic DdPAC-mediated effects, further supported its main role in synaptic plasticity, while also revealing a broad brain effect of astrocytic activation. Collectively, the data from the second objective position DdPAC as a powerful tool for modulating synaptic plasticity in the brain through targeted manipulation of the cAMP-PKA pathway in astrocytes, while also establishing a robust, minimally invasive method for its in vivo application. Finally, we pursued our third objective of restoring physiological function through light-driven DdPAC stimulation in mouse models of HD and AD. We began by investigating the functional effects of astrocytic DdPAC activation in the two most affected regions in HD, the cortex and striatum. To this end, DdPAC was injected into cortical or striatal astrocytes of the R6/1 mouse model to assess its ability to modulate brain function. First, in cortical DdPAC stimulation experiments, we examined hemodynamic changes using a light scattering imaging technique, followed by an evaluation of motor-related behaviour. Hemodynamic analysis revealed cortical overactivation following acute DdPAC activation in cortical astrocytes of R6/1 mice, a response not observed in wild-type (WT) mice. Moreover, repeated DdPAC stimulation in cortical astrocytes impaired coordination in R6/1 mice, as indicated by the vertical pole test, while enhancing motor learning in WT mice, assessed by the ARR. Notably, post-mortem analysis revealed increased GFAP expression only in WT mice after repeated stimulation and behavioural assessments. Next, we examined motor-related behaviour following DdPAC stimulation in striatal astrocytes. In this case, astrocytic DdPAC-mediated cAMP modulation impaired coordination in both WT and R6/1 mice, while sparing motor learning. Additionally, GFAP expression was elevated in both WT and R6/1 mice. Taken together, these results suggest that astrocytic DdPAC modulation varies depending on the brain region and molecular context, leading to distinct outcomes in the cortex and striatum of WT and R6/1 mice. Moreover, our data suggest that increased cAMP levels in astrocytes are detrimental in HD; therefore, strategies aimed at specifically reducing astrocytic cAMP may offer greater therapeutic potential for the disease. In parallel, we investigated the effects of DdPAC-mediated cAMP signalling in neurons and astrocytes of the hippocampus, the most affected region in AD. For this purpose, we injected DdPAC into hippocampal neurons and astrocytes from WT and 5xFAD mice, followed by histological and proteomic analyses. Notably, histological analyses revealed a reduction in GFAP expression and amyloid-β deposits in the hippocampus where DdPAC was activated in astrocytes, but not where DdPAC was activated in neurons. Proteomic analysis of DdPAC-activated astrocytes revealed a response primarily associated with glial activation and immune processes, as well as synaptic plasticity, whereas neuronal activation predominantly influenced synaptic plasticity. In both cases, cytoskeletal regulation emerged as a key function, though the implicated proteins differed between neurons and astrocytes. Additionally, the effects of DdPAC activation in either neurons or astrocytes varied between WT and 5xFAD mice, indicating a differential effect dependent on the molecular context. These findings further support the notion that the effects of DdPAC modulation are dependent on brain region, molecular context, and cell type specificity. In summary, this thesis provides new insights into the cAMP pathway in synaptic plasticity and neurodegenerative disorders. First, our data demonstrates the involvement of neuronal cAMP in M2 cortical behaviours and reveal altered neuronal cAMP dynamics in HD mice. Additionally, we identify early motor and psychiatric M2-cortex-related impairments, highlighting the potential for early therapeutic interventions. To facilitate in vivo application, we establish a minimally invasive method for AAV delivery that successfully achieves transgene expression in specific cell types and mouse strains. Notably, we uncover the capacity of DdPAC-mediated cAMP signalling modulation to enhance synaptic plasticity in the cortex, particularly when activated in astrocytes. In the context of neurodegeneration, DdPAC activation in HD and AD models produces differential effects: in HD, cortical astrocyte activation improves motor learning in WT but impairs coordination in HD mice, while striatal astrocyte activation disrupts coordination in both. In AD, increasing cAMP in hippocampal astrocytes reduces astrogliosis and Aβ deposits, whereas neuronal activation decreases microglial reactivity. Proteomic analysis of hippocampal samples reveals distinct DdPAC-driven proteomic changes in neurons and astrocytes, as well as between WT and AD mice, linking cAMP-PKA pathway activation to synaptic plasticity and immune responses. In conclusion, this thesis reveals new roles for cAMP signalling and propose it as a promising therapeutic target for neurodegenerative diseases. Our results show that DdPAC-mediated modulation of cAMP in both neurons and astrocytes profoundly affects neuronal plasticity, with astrocytic cAMP-PKA modulation producing more widespread effects. Additionally, our findings highlight the importance of brain region and molecular context in shaping the outcomes of cAMP modulation, as DdPAC activation produces distinct effects in the cortex, striatum, and hippocampus, which vary depending on the disease state. Ultimately, we provide strong evidence for DdPAC as a versatile tool to modulate cAMP-PKA signalling, with potential applications in neuroscience research and therapeutic development.
TesiCaracterización de la composición del microbioma y resistoma intestinal en pacientes con alto riesgo de adquisición de microorganismes multirresistentes(Universitat de Barcelona, 2025-05-29) Rubio García, Elisa; Vila Estapé, Jordi; Casals-Pascual, Climent; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] La resistencia antimicrobiana (RAM) es un problema de salud pública agravado por el uso excesivo de antibióticos y la falta de desarrollo de nuevos fármacos. Los microorganismos multirresistentes (MM) colonizan el microbioma intestinal humano, aumentando el riesgo de infección, especialmente en entornos hospitalarios. La microbiota intestinal desempeña un papel clave en la resistencia a la colonización por MM, mientras que el resistoma intestinal incluye los determinantes genéticos de resistencia del microbioma. Los pacientes críticos y las personas con VIH (PLWH) tienen un riesgo más elevado de adquirir MM debido a alteraciones en su microbioma intestinal, el contacto con el entorno hospitalario y una mayor frecuencia de consumo de antibióticos. En pacientes críticos, estas alteraciones del microbioma se asocian a un riesgo mayor de desarrollar infecciones graves y mortalidad. En las PLWH, el microbioma alterado contribuye a la inflamación crónica, y aunque la terapia antirretroviral (TAR) mejora su salud general, esta no es capaz de restaurar completamente la microbiota. Esta tesis se basa en cuatro hipótesis principales: el microbioma intestinal influye en la adquisición de MM y en el pronóstico en pacientes críticos; los presentadores tardías con VIH-1 tienen un riesgo más alto de adquirir MM; los factores que afectan al microbioma intestinal también influyen en la composición del resistoma; y algunos fármacos antirretrovirales (ARV) alteran el microbioma y el resistoma debido a su actividad antibacteriana. Los objetivos incluyen caracterizar el microbioma intestinal en pacientes críticos, estudiar la colonización por MM en presentadores tardías con VIH, analizar el resistoma en PLWH y evaluar la actividad antibacteriana de los ARV. Para responder estos objetivos, se llevaron a cabo diferentes estudios. En el Artículo 1, se analizó el microbioma intestinal de 62 pacientes ingresados en una UCI hepática, identificando que una mayor diversidad bacteriana y la abundancia de ciertos taxones, como Family XI incertae sedis y Prevotella, se asociaban a un menor riesgo de infección y mortalidad, mientras que Enterococcaceae se relacionaba con un peor pronóstico. En el Manuscrito 1, se analizó el microbioma intestinal en 149 ingresos en la UCI, mostrando que la sepsis estaba vinculada a una menor diversidad del microbioma intestinal y a una mayor presencia de Enterococcus y Klebsiella, mientras que Bacteroides, Prevotella y otros anaerobios eran más abundantes en pacientes sin sepsis. En el Manuscrito 2, se analizó la colonización por MM en pacientes con VIH avanzado sin TAR (CD4+ <100 células/mm³), encontrando una tasa de colonización del 63,9%, con un 15,2% de cepas productoras de carbapenemasa OXA-48, lo que sugiere un perfil de resistencia más alto que en otras poblaciones de riesgo. Además, en el Artículo 2, se analizó el resistoma intestinal en 129 personas con VIH-1 y 27 controles, mostrando que éste no variaba significativamente con la infección por VIH-1, pero sí según factores como el enterotipo, la riqueza genética del microbioma intestinal y la preferencia sexual. Finalmente, en el Artículo 3, se evaluó la actividad antibacteriana in vitro de 16 ARV, identificando que la Zidovudina, Abacavir, Efavirenz, Bictegravir y Elvitegravir tienen actividad frente a bacterias comensales de la microbiota humana, y este último podría utilizarse contra MM Gram-positivos. Las conclusiones de esta tesis destacan que la composición del microbioma influye en la adquisición de MM y en la evolución de los pacientes críticos y con VIH avanzado. Factores como la diversidad microbiana y el uso de antibióticos impactan en la mortalidad y el riesgo de sepsis en la UCI. En PLWH, el resistoma intestinal se ve afectado por determinantes del microbioma, y ciertos ARV tienen actividad antibacteriana, lo que podría tener implicaciones terapéuticas.- TesiDiscovery, evaluation and optimization of new antimicrobials against multidrug resistant bacteria(Universitat de Barcelona, 2023-07-27) Moreno Morales, Javier; Ballesté Delpierre, Clara Celia; Vila Estapé, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[eng] Antimicrobial resistance is a global problem, reducing the effectiveness of drugs used to treat infections caused by microorganisms. In 2019, antibiotic resistance is estimated to have caused 1.27 million deaths related to bacterial infections. The World Health Organization has stressed the importance of addressing this problem and looking for new antibiotics effective against multidrug-resistant bacteria. Antimicrobial peptides are molecules of the defense system of different organisms that they use to protect themselves from pathogens. They have antimicrobial properties and have been shown to be effective against multidrug-resistant bacteria. In this doctoral thesis project, antimicrobial peptides have been designed, optimized and developed, as well as antimicrobial peptides with photoswitchable structures. It is hypothesized that the design and optimization of these peptides by means of different strategies will produce structures with good antibacterial activity and low toxicity. In addition, the creation of a photoswitchable peptide that allows the control of antimicrobial activity in the environment and reduces the development of resistance is proposed. Specific objectives include the optimization of peptides derived from CAP-18 and optimization of a cyclic peptide based on protegrin-1 and called PLP-3, the evaluation of antimicrobial activity and toxicity, and the study of its effect on bacterial cells of all engineered peptides. It also seeks to analyze the antimicrobial activity of photochangeable analogues of thyrocidine A and their toxicity. The results show that the peptides derived from CAP-18 have a potent antimicrobial activity against multidrug-resistant strains of A. baumannii and P. aeruginosa, with a low toxicity and bactericidal effect. By viewing samples of these bacterial species under the action of CAP-18 derivatives, it is observed that these bacterial cells suffer damage to their membrane, consequent to an antimicrobial mechanism of action of membrane disruption. PLP-3 also demonstrates high antimicrobial activity against multidrug-resistant strains of A. baumannii, K. pneumoniae and P. aeruginosa, low toxicity at clinically relevant concentrations for pathogen inhibition and membrane permeabilization of A. baumannii and P. aeruginosa strains. The designed photoswitchable derivatives have effective antimicrobial activity against resistant bacteria, and their activity is precisely modulated by irradiation with red light and natural light, leading to their inactivation. These results suggest that photoswitchable antibiotics based on antimicrobial fungi could be a promising strategy for the development of new antimicrobial agents addressing the problem of the emergence of antibiotic resistance in environmental bacteria. These advances contribute to the development of new antibiotics effective against multidrug-resistant bacteria and address the problem of the spread of antimicrobial resistance.
- TesiEvaluación de nuevos trazadores y dispositivos para la detección híbrida del ganglio centinela en el cáncer ginecológico(Universitat de Barcelona, 2022-09-27) Sánchez Izquierdo, Nuria; Paredes Barranco, Pilar; Pons Pons, Francisca; Vidal i Sicart, Sergi; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] INTRODUCCIÓN: La biopsia selectiva del ganglio centinela (BSGC) ha sido recientemente incluida en las guías clínicas en los casos de cáncer de endometrio de bajo riesgo y en 2019 se ha considerado su aplicación en el cáncer de endometrio de alto riesgo, sin que haya consenso entre los centros sobre cómo actuar ante el cáncer de endometrio de riesgo intermedio. Además, la BSGC está aceptada en estadios precoces de cáncer de cérvix. La tasa de detección más elevada del ganglio centinela (GC) se obtiene mediante la combinación de un radiotrazador ([99mTc]Tc-nanocoloide de albúmina) más un colorante vital, con mejores resultados que cuando se aplican independientemente. Por otra parte, se han utilizado, de forma aislada, trazadores no radioactivos fluoróforos como el verde de indocianina (ICG) para la detección visual (fluorescente) del GC. En los últimos años se ha desarrollado un trazador dual o híbrido ([99mTc]Tcnanocoloide de albúmina-ICG) que combina las propiedades beneficiosas de ambas modalidades (radiotrazador y trazador fluorescente). Este trazador dual permite obtener un mapa linfático previo a la intervención e identificar intraoperatoriamente los ganglios linfáticos mediante detección híbrida de cada uno de los componentes con sondas detectoras y cámaras de visión óptica especializadas. Este trazador híbrido ha sido utilizado en la BSGC de diferentes tipos de tumores pelvianos como el cáncer de próstata, pene y vulva, proporcionando una alta tasa de detección del GC, demostrando un rendimiento superior al uso exclusivo de cada uno de sus componentes por separado o del colorante vital. Sin embargo, la utilización de este trazador híbrido y su aplicación y viabilidad en la detección del GC en tumores ginecológicos uterinos no ha sido estudiada actualmente. HIPÓTESIS: La utilización de un radiotrazador híbrido así como, su detección pre e intraoperatoria permitirá una mejor tasa de localización y BSGC que la de los trazadores utilizados actualmente en los tumores uterinos donde esté indicada. OBJETIVOS: Evaluar la viabilidad y aplicabilidad del radiotrazador híbrido, en el estudio prequirúrgico así como su detección intraoperatoria en la localización del GC de tumores ginecológicos uterinos de endometrio y de cérvix. METODOLOGÍA Estudio retrospectivo en pacientes derivadas a la Unidad de Ginecología Oncológica del Hospital Clínic con cáncer de cérvix y endometrio, a las que se les realizó la BSGC mediante la detección híbrida de [99mTc]Tc-nanocoloide de albúmina-ICG. RESULTADOS: La BSCG mediante la aplicación de un radiotrazador híbrido ([99mTc]Tc-nanocoloide de albúmina-ICG) en pacientes con cáncer de cérvix inicial y cáncer endometrial de riesgo intermedio y alto es viable, proporcionando una tasa de detección del GC superior a la del colorante azul y radiotrazador convencional.
- TesiShedding light on Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli biofilms: from characterisation to new treatments(Universitat de Barcelona, 2022-05-27) Ballén Torres, Victoria; Soto González, Sara M.; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] Las biopelículas son un gran problema sanitario mundial debido a su inherente tolerancia a los tratamientos antimicrobianos. Aunque algunas de ellas son monomicrobianas, muchas otras son comunidades polimicrobianas, en las que se incluyen ciertas infecciones humanas. Los mecanismos subyacentes a la formación de biopelículas no se conocen del todo, y muchos genes de virulencia o incluso genes de resistencia a los antimicrobianos pueden estar implicados en este proceso. La identificación de nuevos genes que podrían estar asociados a la formación de biopelículas, así como el descubrimiento de nuevas moléculas para inhibirlos o erradicarlos es actualmente un objetivo prioritario en investigación. Por ello, esta tesis se centra en el estudio de la formación de biopelículas desde diferentes ángulos. En primer lugar, hemos analizado las interacciones entre especies bacterianas en las infecciones del tracto urinario, concretamente en la biopelícula formada por K. pneumoniae y E. faecalis, encontrando una interacción antagónica entre ellas debido a la produccion de ácido láctico por parte de E. faecalis. Dicho antagonismo se observó al utilizar caldo tripticasa de soja u orina humana enriquecidos con glucosa. Sin embargo, interacciones neutras fueron observadas cuando el medio en el que la biopelícula se desarrolló no contenía glucosa. Estos hallazgos nos llevan a seguir investigando a las bacterias lácticas como posibles agentes de control biológico de la formación de biopelículas en los catéteres permanentes en el contexto de las infecciones del tracto urinario. En segundo lugar, hemos buscado nuevos genes implicados en la formación de biopelículas en E. coli mediante el uso de mutagénesis aleatoria por inserción de un transposón. En la mutante denominada Tn263, el transposón se insertó en el gen purL, que codifica la 5'-fosforibosil-formil-glicinamida amidotransferasa, implicada en la vía biosintética de novo de las purinas. Los análisis de las cepas Tn263, ¿purL::cat y ¿purL/purL+ mostraron que ¿purL::cat, al igual que la mutante Tn263, también había perdido la capacidad de formar biopelículas y dio lugar a colonias de color rosa claro asociadas a fenotipos de curli defectuosos en agar rojo congo. La cepa complementada ¿purL/purL+ mostró valores de absorbancia similares a los de la cepa salvaje y restauró su capacidad de formar fimbrias curli y biopelículas. Además, las cepas Tn263 y ¿purL::cat recuperaron su capacidad de formar biopelículas cuando se añadió inosina monofosfato al medio. Estos resultados demuestran el papel crucial del gen purL y de la vía de biosíntesis de purinas en la producción de curli y, por tanto, en la producción de biopelículas. Así, podemos afirmar que los genes involucrados en las vías biosintéticas de los nucleótidos pueden ser excelentes objetivos para potenciales compuestos antibiopelícula. En nuestro siguiente objetivo, investigamos una nueva molécula de origen natural con actividad proteolítica que podría considerarse en el futuro para tratar las biopelículas formadas por bacterias Gram negativas y Gram positivas. Este extracto de fruta demostró tener actividades antimicrobiana y antibiopelícula, así como efecto bactericida a 2x CMI y 4x CMI tras 24 horas de incubación. Sin embargo, el valor IC50 obtenido mediante el ensayo de XTT en células Jurkat, fue impreciso debido a la viscosidad y turbidez del extracto de fruta. Aunque los valores de CMI obtenidos (que oscilaron entre 35 mg/mL y 50 mg/mL) y MBEC (que oscilaron entre 150 mg/mL y 400 mg/mL) son alentadores, estos valores podrían mejorarse si pudiéramos probar la molécula activa del extracto en nuestras cepas. Una vez conseguido esto, el extracto de fruta con enzimas proteolíticas podría ser un nuevo y prometedor agente antimicrobiano y antibiopelícula. Por último, hemos analizado si el origen de las cepas, los perfiles de resistencia a los antimicrobianos o la presencia o ausencia de diferentes determinantes de virulencia en una colección de cepas de E. coli y K. pneumoniae podrían estar relacionados con su capacidad para formar biopelículas. En el análisis realizado con las cepas de K. pneumoniae, encontramos que las fimbrias y la enterobactina están presentes en prácticamente todas las cepas clínicas analizadas. También encontramos el gen rmpA y el fenotipo hipermucoviscoso en una proporción significativa en nuestro estudio. Como se ha observado en estudios anteriores, observamos una prevalencia considerable de genes codificadores de yersiniabactina entre los aislados del tracto respiratorio, lo que confirma el papel crucial de la yersiniabactina en las infecciones pulmonares. Además, encontramos una asociación estadísticamente significativa entre el gen asociado a la cápsula uge y el origen de los aislados, con la mayoría de los aislados procedentes de orina portando este gen. Al analizar si la existía correlación entre la formación de biopelículas y el origen de los aislados, observamos que las cepas de orina formaban más biopelículas que los aislados del torrente sanguíneo o del tracto respiratorio y adicionalmente, las cepas de origen urinario eran más productoras de betalactamasas que las cepas respiratorias o sanguíneas. En cuanto a los resultados observados en el análisis de las cepas de E. coli, los perfiles de resistencia a los antimicrobianos en nuestra colección mostraron los mayores porcentajes de resistencia con ciprofloxacina, trimetoprim-sulfametoxazol y ampicilina, y encontramos un porcentaje significativo de cepas con genes que codifican Betalacatamasas de espectro extendido, siendo blaCTX-M-15 la más común. En cuanto a la clasificación por grupos filogenéticos, los aislados pertenecientes a los grupos filogenéticos B2 y D tenían una mayor capacidad de formación de biopelículas que los demás grupos filogenéticos. También encontramos una correlación estadísticamente significativa entre la formación de biopelículas y la presencia de varios sideróforos, adhesinas o toxinas. Uno de los hallazgos más notables de nuestro estudio fue la relación estadísticamente significativa entre los genes que codifican colibactina y la formación de biopelículas. En nuestro estudio, se encontró un gran porcentaje de cepas de E. coli positivas para colibactina, la mayoría de ellas formadoras de biopelículas, pertenecientes al grupo filogenético B2, con una tasa de resistencia a los antimicrobianos bastante baja, una gran diversidad clonal y una alta relación con la mayoría de los factores de virulencia estudiados. El papel de la colibactina en las biopelículas y su importancia en diversas enfermedades infecciosas humanas requiere más investigación. Las biopelículas formadas por E. coli y otros patógenos prioritarios también requieren más estudios, ya que en este proceso pueden intervenir factores ambientales u otros factores genéticos aún no identificados.
- TesiEvaluación de los nuevos ensayos basados en las técnicas de biología molecular y proteómica para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas en muestra directa(Universitat de Barcelona, 2021-05-26) Zboromyrska, Yuliya; Vila Estapé, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] Hipótesis: En los últimos años la necesidad de un diagnóstico rápido en el ámbito de las enfermedades infecciosas se ha hecho muy evidente, debido principalmente a dos factores: 1. Los avances tecnológicos, sobre todo en el área de diagnóstico molecular y de proteómica; 2. Los estudios que han demostrado claramente que el correcto manejo y el adecuado tratamiento antimicrobiano de los pacientes graves durante las primeras horas tiene un impacto directo en la mortalidad y la supervivencia. Nuestra hipótesis consiste en que los nuevos métodos moleculares, disponibles comercialmente, así como la aplicación de la EM MALDI-TOF directamente a las muestras clínicas permiten acortar los tiempos de respuesta y pueden ser incorporados como técnicas complementarias al diagnóstico convencional en los laboratorios de microbiología clínica, produciendo un importante impacto clínico. Objetivo general: Evaluar las técnicas de biología molecular y proteómica para la identificación de microorganismos a partir de muestras directas de sangre y orina, respectivamente. Del objetivo general derivan cinco objetivos específicos, dependiendo del tipo de muestra a la que se aplican las técnicas de diagnóstico: 1. Identificación de patógenos causantes de bacteriemia mediante técnicas basadas en biología molecular a partir de la muestra directa de sangre 1.1 Evaluar la utilidad de GeneXpert MRSA/SA BC aplicado a la sangre directa extraída a través del catéter para el diagnóstico de bacteriemia estafilocócica relacionada con catéter. Artículo 1. 1.2 Evaluar la técnica MagicPlex para el diagnóstico de bacteriemia a partir de sangre directa. Artículo 2. 2. Identificación de patógenos causantes de ITU mediante EM MALDI-TOF a partir de la muestra directa de orina 2.1 Proponer y evaluar un protocolo de identificación directa a partir de la muestra de orina mediante EM MALDI-TOF. Articulo 3 2.2 Evaluar el protocolo propuesto para la identificación directa a partir de la muestra de orina mediante EM MALDI-TOF en un estudio multicéntrico. Articulo 4 2.3 Implementar el protocolo de identificación directa combinado con las técnicas rápidas de detección de BLEE y carbapenemasas en la rutina de diagnóstico de ITU en el Hospital Clínic y analizar su impacto clínico. Manuscrito 5.
- TesiDiagnóstico y vigilancia de las infecciones por arbovirus(Universitat de Barcelona, 2020-12-11) Alejo Cancho, Izaskun; Martínez Yoldi, Miguel Julián; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] INTRODUCCIÓN: Los arbovirus son un grupo heterogéneo de virus transmitidos por vectores artrópodos. Entre ellos destacan los virus dengue (VDEN), chikungunya (VCHIK) y Zika (VZIK), que presentan similitudes en cuanto a su distribución geográfica, vectores transmisores y cuadro clínico que ocasionan. Existe un alto riesgo de emergencia y re-emergencia de los mismos debido, entre otros, al gran número de viajeros entre zonas endémicas y no endémicas y a la expansión de diferentes vectores. Unas técnicas diagnósticas fiables y rápidas son de vital importancia para hacer frente a este riesgo. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: Una evaluación rigurosa de diferentes métodos diagnósticos y de la cinética de los marcadores de infección permitirá la creación de algoritmos diagnósticos que mejoren el diagnóstico de las arbovirosis. La revisión de los resultados obtenidos por los protocolos vigentes permitirá estimar el riesgo de infección y afectación fetal por VZIK en embarazadas. Los objetivos de este trabajo son: estudiar la cinética de la infección por VZIK, evaluar el cribado serológico de VZIK llevado a cabo en embarazadas en Cataluña, analizar la utilidad de los parámetros analíticos para orientar el diagnóstico del síndrome febril en viajeros, evaluar el rendimiento de un nuevo ensayo de inmuno-aglutinación magnética (IMA) para detectar antígeno NS1 de VDEN e investigar la utilidad de otras técnicas serológicas para el diagnóstico de las infecciones por VDEN, VCHIK y VZIK. MATERIAL Y MÉTODOS : Se estudió la presencia de VZIK en muestras de suero y orina de 24 pacientes con infección por VZIK mediante RT-PCR en tiempo real. Se investigó la presencia de VZIK en semen en un paciente mediante métodos moleculares y cultivo celular utilizando muestras seriadas. Se evaluaron los resultados del cribado de VZIK y el impacto sobre el embarazo en 1.057 gestantes cribadas para VZIK en Cataluña en 2016. Se estudiaron los valores de plaquetas y leucocitos en 1.218 viajeros provenientes del trópico para determinar la utilidad de la plaquetopenia y leucopenia en el diagnóstico de malaria y arbovirosis. Se estudió el rendimiento diagnóstico de un método de IMA para detectar antígeno NS1 de VDEN en un panel de 135 muestras que incluía los cuatro serotipos de VDEN, y se comparó con las técnicas de ELISA e inmunocromatografía (ICT). También se exploró la utilidad diagnóstica de un test rápido de dengue, de un ELISA basado en la proteína NS1 de VZIK para detectar anticuerpos y de un ensayo de inmunoblot para diferenciar infecciones por VDEN, VZIK y VCHIK, comparando los resultados con los de las técnicas diagnósticas de rutina. RESULTADOS PRINCIPALES : Se detectó la presencia del VZIK por RT-PCR en tiempo real en muestras de suero y orina fuera de los períodos considerados óptimos en aquel momento por las recomendaciones de organismos internacionales. Se detectó la presencia de ARN de VZIK en semen 93 días desde el inicio de los síntomas, sin poder aislar el virus en cultivo celular. Los datos del cribado serológico de VZIK de 1.057 embarazadas en Cataluña mostraron un 13,4% de gestantes con alguna evidencia serológica de infección por VZIK, siendo la prevalencia de efectos fetales adversos (aborto o microcefalia) del 3,1%. La leucopenia (<4x109 leucocitos/L) y la trombocitopenia (<150x109 plaquetas/L) mostraron un valor predictivo negativo del 98,1% para el diagnóstico de arbovirosis y malaria respectivamente, en viajeros con síndrome febril a la vuelta de un viaje al trópico. El ensayo de IMA para detectar NS1 de VDEN mostró una elevada sensibilidad (91,9%) y especificidad (98,4%), comparables a la técnica de ELISA pero obteniendo los resultados de forma tan rápida como una ICT. El test rápido para VDEN basado en ICT mostró un la detección de IgM frente al virus. La técnica de ELISA para la detección de IgG utilizando como antígeno NS1 de VZIK mostró una sensibilidad del 92,9% y una especificidad del 87,0% comparándola con el ensayo de microneutralización. El ensayo basado en inmunoblot mostró una baja sensibilidad (<40%) para la detección de IgM frente a VDEN, VZIK y VCHIK. CONCLUSIONES: El testado simultáneo de suero y orina mediante métodos moleculares aumenta el rendimiento diagnóstico para la detección de infecciones por VZIK. El VZIK puede persistir en semen durante periodos prolongados de tiempo. La frecuencia de desenlaces adversos por VZIK en embarazadas atendidas en Cataluña fue similar a la descrita en la literatura en algunas zonas endémicas. Los valores de leucocitos y plaquetas pueden ayudar en el despistaje clínico inicial de pacientes con fiebre a la vuelta de un viaje al trópico. El ensayo de IMA es una herramienta útil para el diagnóstico rápido de dengue agudo. La evaluación de nuevas técnicas diagnósticas para arbovirosis es necesaria para determinar su utilidad a fin de intentar solucionar las limitaciones del diagnóstico serológico.
- TesiModelos experimentales aplicados al estudio de la eficacia y la seguridad de los antipsicóticos(Universitat de Barcelona, 2022-07-13) Martínez Pinteño, Albert; Rodríguez Ferret, Natalia; Gassó Astorga, Patricia; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] La esquizofrenia es un trastorno psicótico grave con una prevalencia aproximada del 0,75% que se caracteriza por la presencia de síntomas positivos, negativos y déficits cognitivos. La enfermedad se inicia con una fase prodrómica donde los individuos presentan síntomas subclínicos que evidencian el deterioro funcional. El primer episodio psicótico (PEP) generalmente ocurre entre el final de la adolescencia y el principio de la edad adulta. Una vez diagnosticada sigue un curso fluctuante dando lugar a crisis psicóticas. En cuanto al tratamiento, los antipsicóticos son la única clase de fármacos con eficacia comprobada. No obstante, estos fármacos resultan ineficaces en el tratamiento de algunos de los síntomas de la enfermedad, como los síntomas negativos y los déficits cognitivos. Además, el uso de antipsicóticos conduce a la aparición de efectos adversos en algunos pacientes, entre los que destaca el síndrome metabólico. En la actualidad, no conocemos los mecanismos por los cuales algunos antipsicóticos inducen estas alteraciones metabólicas. Dado que el tratamiento actual con antipsicóticos presenta efectos secundarios y su efectividad se reduce al control de síntomas positivos, se están desarrollando nuevos fármacos. En base a la hipótesis glutamatérgica de la esquizofrenia, el JNJ-46356479 (JNJ), un modulador alostérico positivo de los receptores metabotrópicos de glutamato de tipo 2, podría resultar eficaz en el tratamiento de este trastorno. La presente tesis doctoral tiene como objetivo profundizar en los mecanismos moleculares involucrados en la aparición del síndrome metabólico inducido por antipsicóticos con el fin último de identificar marcadores predictivos de este efecto adverso, así como evaluar la eficacia del JNJ en distintos modelos experimentales. En concreto, se pretende identificar los cambios de expresión génica en ratón inducidos por el tratamiento antipsicótico que nos permitan hallar procesos biológicos y potenciales genes candidatos relacionados con el desarrollo de alteraciones metabólicas. En cuanto a la eficacia, se busca valorar el efecto neuroprotector y la actividad antiapoptótica del JNJ, en comparación con clozapina, en una línea celular de neuroblastoma humano, así como, evaluar su capacidad para revertir las alteraciones neuropatológicas y cognitivo-conductuales en un modelo animal de esquizofrenia generado mediante la administración postnatal de ketamina. Los resultados obtenidos indican que los antipsicóticos modifican la expresión de diversos genes involucrados en la regulación de los procesos metabólicos y señalan a EP300 como un gen candidato de las anomalías metabólicas inducidas por estos fármacos. Por otra parte, el tratamiento con JNJ ha demostrado no ser neurotóxico y atenuar la apoptosis, particularmente la activación de caspasa-3 inducida por dopamina y glutamato, en la línea celular de neuroblastoma. Además, el tratamiento con JNJ, administrado en ratones durante la adultez o de forma precoz en etapas correspondientes a la fase prodrómica de la enfermedad, ha mejorado parcialmente los déficits neuropatológicos y los síntomas negativos y cognitivos, mostrando una mayor eficacia que el tratamiento con clozapina. En conclusión, EP300 y los genes implicados en su red de interacción podrían considerarse genes candidatos para futuros estudios farmacogenéticos del síndrome metabólico inducido por antipsicóticos. Por otro lado, el JNJ podría ser un tratamiento eficaz para la esquizofrenia, aunque serían necesarios más estudios.
- TesiNuevos métodos para el diagnóstico microbiológico de la neumonía(Universitat de Barcelona, 2021-06-03) Vergara Gómez, Andrea; Vila Estapé, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] La neumonía es una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial y presenta una gran morbilidad asociada. El correcto diagnóstico de esta infección es crucial para el paciente y, en concreto, el diagnóstico microbiológico es esencial para asegurar un tratamiento antibiótico óptimo. Sin embargo, sólo se consigue determinar la etiología en la mitad de los casos aproximadamente, lo que conlleva un tratamiento inadecuado en muchos casos. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas que permitan un diagnóstico rápido y adecuado de la neumonía. Los objetivos de esta tesis son diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) para la identificación de las principales bacterias y virus implicados en la neumonía intrahospitalaria (NIH), incluida la asociada a la ventilación mecánica (NAVM), diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en estas bacterias, y evaluar la lipocalina-2 (LCN2) como biomarcador de neumonía. Para cubrir el primer objetivo, se desarrolló y evaluó una LAMP para detectar Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Acinetobacter baumannii a partir del ADN extraído mediante un método rápido de muestras de lavado broncoalveolar (LBA), aspirado traqueal (AT) y broncoaspirado (BAS). Además, se desarrolló y evaluó una LAMP para la detección del virus herpes simple-1 (VHS-1) a partir de LBA con y sin extracción de ADN. Por último, se evaluó el papel del citomegalovirus (CMV) en LBA de pacientes críticos y se desarrolló y evaluó una LAMP para su detección. En cuanto al segundo objetivo, se evaluó una LAMP comercial para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en Enterobacterales y Acinetobacter spp. tanto a partir de cepas como de muestras respiratorias. Finalmente, como parte del tercer objetivo, se evaluó la utilidad de la LCN2 en plasma y LBA para el diagnóstico de NAVM en un modelo animal porcino. Además, se evaluó la utilidad de la concentración plasmática de LCN2 para determinar la etiología (bacteriana frente a no bacteriana), gravedad y pronóstico de pacientes adultos con neumonía adquirida en la comunidad (NAC) admitidos en Urgencias. La técnica LAMP presentó una elevada sensibilidad y especificidad para detectar los principales microorganismos causantes de NIH (bacterias y virus) de forma barata, rápida, sensible y específica. El sistema comercial basado en LAMP evaluado demostró ser una buena herramienta para la detección de diferentes genes de resistencia a antibióticos β- lactámicos en Enterobacterales así como en Acinetobacter spp. con un tiempo de respuesta rápido. En condiciones de alta concentración de bacterias, el método LAMP presentó buenos resultados cuando se realizó sin un paso previo de extracción de los ácidos nucleicos, reduciendo el tiempo de respuesta. Por otro lado, se observó un aumento de los niveles de LCN2 en los animales que desarrollaban NAVM, especialmente marcado en el LBA. La capacidad de la LCN2 como biomarcador para discriminar la etiología de la NAC fue limitada, pero la concentración de LCN2 se asoció con la gravedad y el ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos en pacientes adultos con NAC. Los trabajos incluidos en esta tesis doctoral podrían contribuir a la mejora del diagnóstico precoz, manejo e identificación de especies causantes de neumonía y, por tanto, al tratamiento óptimo que permitiría la reducción de la morbi-mortalidad asociada.
- TesiNot the usual suspects: membrane translocation, pathogenic potential and bacterial species of the Acinetobacter baumannii group(Universitat de Barcelona, 2019-02-08) Cosgaya Castro, Clara; Vila Estapé, Jordi; Roca Subirà, Ignasi; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[eng] The most clinically relevant species of the Acinetobacter genus are comprised within the Acinetobacter baumannii group (Ab group, i. e. A. baumannii, Acinetobacter nosocomialis, Acinetobacter pittii, Acinetobacter seifertii and A. pittii-like/A. dijskhoorniae). Among these species A. baumannii is the most prevalent and usually shows multidrug resistance. This, and the fact that the Ab group species cannot be distinguished by phenotypic methods, has led to the misidentification of the species of the Ab group as A. baumannii in the clinical settings. Nevertheless, in the last years the incidence of the other species of the Ab group has risen, partly due to the use of molecular techniques and mass spectrometry tools. This thesis has characterised, using both genotypic (rpoB-based and MLSA phylogenetic analyses, and whole genome sequence analysis) and phenotypic (carbon utilisation assays and MALDI-TOF MS) techniques, a group of strains mainly recovered from human samples that represents a new bacterial species within the Ab group for which the name of Acinetobacter dijkshoorniae has been proposed. The genome of the type strain of the novel species has been sequenced and the identification of the species of the Ab group by MALDI-TOF MS has been optimised, since the novel species (A. dijkshoorniae and A. seifertii) could not be identified by this technique prior to this study. MALDI-TOF MS was shown to be rapid and accurate in the discrimination of all the species of the Ab group, indicating its suitability for the implementation of this technique in the clinical settings. In addition, the use of MALDI- TOF MS allowed the identification of members of the Ab group in market meat from Peru, leading to the first identification of A. dijkshoorniae from food and in South America. We also evaluated the differences among the species of the Ab group beyond those at the taxonomic level and found that while A. baumannii still presents the higher rates of antimicrobial resistance, this species and A. nosocomialis, which usually are more prevalent in our hospitals and have worst outcomes, showed a minor pathogenicity in terms of biofilm formation and virulence in the Caenorhabditis elegans infection model. In contrast, A. pittii, A. seifertii and A. dijkshoorniae presented a higher pathogenicity in the phenotypes studied. This data suggests the emergence of the non-baumannii species of the Ab group as well as different degrees of adaptation to the human host and the need of studying them as distinct entities. The rise on the antimicrobial resistance of A. baumannii has drastically reduced the therapeutic options left to treat infections caused by this pathogen. In view of the lack of effective antimicrobial drugs there is an urgent need for novel therapeutic approaches. In order to find novel targets for the development of antimicrobial drugs against A. baumannii, we evaluated the dual role of transport-related proteins in antimicrobial resistance and virulence using a transposon mutant strain collection derived from the A. baumannii AB5075 strain. The antimicrobial susceptibility of the mutant strains was compared against the wild- type strain and led to the identification of novel antimicrobial substrates for known efflux pumps and uncharacterised transport-related proteins which seem to participate in the transport of antibiotics across membranes. The evaluation of the virulence in the Galleria mellonella infection model also identified transport-related proteins putatively involved in the virulence of A. baumannii. This results are still preliminary but show the dual role of transport- related proteins in the antimicrobial resistance and pathogenicity of A. baumannii and open a new line of research that might help to gain further knowledge about the virulence of this pathogen while finding novel targets for the development of new antimicrobial drugs against A. baumannii.
- TesiPatologia per amiant a la comarca del Vallès Occidental (Barcelona)(Universitat de Barcelona, 2019-03-01) Tarrés Olivella, Josep; Canela i Soler, Jaume; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[cat] INTRODUCCIÓ: L’amiant o asbest es un mineral que ha estat molt utilitzat per la industria de l’estat espanyol durant el segle XX, la inhalació d’aquest silicat pot provocar patologia pleuropulmonar a Cerdanyola del Vallès, comarca del Vallès Occidental de la província de Barcelona es va instal·lar i va estar en funcionament durant 90 anys la major fabrica del país de fibrociment, del que l’amiant és un dels principals components. OBJECTIU: L’objectiu principal ha estat valorar si l’activitat industrial d’aquesta fàbrica de fibrociment ha condicionat l’estat de salut de les poblacions properes. Altres objectius han estat elaborar un protocol d’estudi que fos d’utilitat per a futurs treballs i contribuir a establir els factors determinants de la distribució dels mesoteliomes pleurals d’origen ambiental en aquesta comarca. MÈTODE: Aquesta memòria de tesi s’estructura mitjançant l’anàlisi de dos articles prèviament publicats en revistes científiques indexades. RESULTATS: En la primera publicació s’ha posat de manifest que davant de la presencia d’un focus emissor de fibres d’amiant que actua com agent contaminador, la distància i els factors meteorològics locals són els determinants de la distribució dels pacients afectats de mesotelioma pleural d’origen ambiental. En la segona publicació cal significar què es presenta un protocol d’estudi de les patologies per amiant i que aquest, constitueix una eina per aprofundir en la investigació d’aquestes afeccions. CONCLUSIONS: La conclusió general és que els resultats exposats confirmen la hipòtesi global de que l’activitat de la fàbrica de fibrociment ha condicionat l’estat de salut dels habitants de la comarca, no tant sols dels treballadors de la factoria sinó també dels convivents amb treballadors i també dels ciutadans que residien a prop de la mateixa. En aquest últim grup de exposats les conclusions han estat què la distancia del seu domicili al focus emissor i les característiques dels vents locals (direcció i intensitat) tenen un marcat impacte en el risc de desenvolupar un mesotelioma d’origen ambiental. Del segon article la conclusió es de que ara disposem d’un protocol d’estudi científic què és podrà utilitzar per a futurs treballs de investigació.
- TesiEpidemiologia de les rickettsiosis del grup de les febres tacades a Catalunya. Estudi específic de la Rickettsia massiliae Bar 29. Eficàcia de les tècniques diagnòstiques(Universitat de Barcelona, 2019-01-08) Sanfeliu Sala, Isabel; Segura, Ferran; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[cat] ANTECEDENTS. Les rickettsiosis, conegudes des de fa dècades, han passat a ser considerades malalties emergents en els últims anys. HIPÒTESIS. L’espècie de Rickettsia Bar 29, aïllada prèviament de paparres en la nostra àrea, causa infecció subclínica en humans. Aquesta espècie és un agent etiològic de la febre botonosa mediterrània (FBM) en la nostra àrea. El cultiu shell vial i la tècnica de la PCR són tècniques útils per a la detecció de rickèttsies. OBJECTIUS. Realitzar un estudi epidemiològic de la presència de la infecció per R. massiliae Bar 29 en humans, reservoris i vectors a Catalunya, i avaluar l’eficàcia de les tècniques diagnòstiques. METODOLOGIA. Estudis de seroprevalença en humans enfront de Bar 29 per immunofluorescència indirecta (MIF). Detecció de Bar 29 per MIF i Western inmunoblot, cultiu shell vial i PCR en pacients amb sospita de FBM i estudis per MIF en reservoris animals. Estudi en vectors per PCR i per la tècnica Tick-borne Bacteria Flow Chip (Master Diagnóstica). RESULTATS. S’ha trobat una prevalença del 8,5% enfront de Bar 29. L’associació entre Bar 29 i el contacte amb gossos ha estat estadísticament significativa (p= 0,018, OR 3,59 1,29-10,05). S’ha trobat reaccions creuades amb R. conorii en 8 dels sèrums i 10 d’ells han presentat tan sols anticossos enfront de Bar 29. En un primer estudi, de 15 sèrums estudiats enfront de R. conorii i Bar 29, 5 sèrums han presentat títols enfront de Bar 29 superiors a R. conorii, i l’especificitat de les reaccions s’ha confirmat per inmunoblot en dos d’ells. En un estudi posterior amb 136 sèrums, s’han trobat 53 sèrums positius almenys a un dels dos microorganismes, 12 sèrums amb títols superiors a Bar29 i dos casos només amb anticossos enfront de Bar 29. Durant el període 1994-2003, s’ha cultivat la sang de 59 pacients per shell vial. S’han obtingut 6 cultius positius, i s’han confirmat les soques per PCR-RFLP com a R. conorii. En l’estudi de reservoris animals del cicle silvestre (guineus) i del domèstic (ovelles, cabres i bòvids), s’han recollit mostres de sang de 135 guineus, 138 vaques braves, 137 ovelles i 98 cabres. En guineus s’ha trobat un 45,9% de les mostres amb anticossos enfront de R. massiliae Bar29 i un 25,1% a R. conorii. En les vaques se n’ha trobat un 39,8% amb anticossos enfront de R. massiliae Bar 29 i un 26% de R. conorii. En les ovelles, un 20,4% han estat positives a Rickettsia Bar 29 i un 24,8% a R. conorii. Finalment, de les cabres, un 26,5% han estat positives a Rickettsia Bar 29 i un 39,7% a R. conorii. De les guineus s’han recollit 137 paparres del complex Rhipicephalus sanguineus, que s’han analitzat per la tècnica Tick-Borne Bacteria Flow Chip. El 83,2 % han resultat positives a Rickettsia. Un cop seqüenciades aquestes rickèttsies, se n’han identificat 107 com a R. massiliae Bar 29, 3 com a R. aeschlimannii, una com a R. slovaca i en les altres tres sols s’ha arribat a Rickettsia sp.. S’han detectat, a més, 21 coinfeccions amb Bartonella sp., 12 amb Borrelia sp. i tres amb les dues a la vegada. S’han recollit, a més, 117 paparres en fase lliure que s’han identificat dins del grup R. sanguineus. S’han analitzat per la tècnica de Tick-Borne Bacteria Flow Chip. El 94% d’elles han resultat positives a Rickettsia del grup de les febres tacades. Se n’han pogut seqüenciar 85, 71 com a R. massiliae Bar 29 i 14 com a Rickettsia sp., i s’ha detectat en 23 paparres coinfecció amb Borrelia sp. CONCLUSIONS 1. La població humana sana de la nostra àrea presenta una seroprevalença enfront de R. massiliae Bar 29 del 8,5%. 2. Dels resultats dels dos estudis en pacients amb sospita de FBM es pot deduir que un nombre de casos de FBM dels nostres pacients podrien estar causats per R. massiliae Bar 29 . 3. Mitjançant el cultiu shell vial podem arribar a través de PCR i seqüenciació a identificar les diferents espècies de rickèttsies de les soques aïllades. 4. La nova tècnica Tick-Borne Bacteria Flow Chip ens augmenta notablement la sensibilitat respecte a la PCR ompA per a la detecció de rickèttsies en els vectors.
- TesiInterplay of virulence, antibiotic resistance and epidemiology in Escherichia coli clinical isolates(Universitat de Barcelona, 2018-12-04) Guiral Vilalta, Elisabet; Vila Estapé, Jordi; Soto González, Sara M.; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[eng] Escherichia coli are one of the microorganisms most frequently studied worldwide. They are Gram-negative bacilli, facultative anaerobic, rod-shaped bacterium, which are most often found in the gastrointestinal tract as a normal coloniser of warm blood organisms (mainly in mammals, but are also present in birds, reptiles and fish). Taxonomically, E. coli belong to the Enterobacteriaceae family and are an important component of the intestinal microbiota, being involved in some essential metabolic processes such as the production of vitamin K and vitamin B12. E. coli also help to maintain the anaerobic environment needed for most of the microbiota by consuming oxygen that enters the gut and competitively exclude pathogens from the lower intestine of their hosts. E. coli can also adapt to life in an external environment outside hosts, such as soil, water, plants and food, due to their hardiness and metabolic flexibility. Despite establishing symbiotic relationships, this well-known microorganism can also have an important pathogenic role within their hosts, especially from a human point of view. It is able to cause a wide variety of infections that can reach a high prevalence and even cause significant morbidity and mortality. According to a recent report on this topic, it is predicted that three million people will die from a drug-resistant E. coli infection by 2050 if no measures are taken to tackle the problem of antimicrobial resistance. Although this figure exceeds that expected in a developed continent, it demonstrates the presence of an emerging health threat - antimicrobial resistance. Bacterial pathogenicity is defined as the genetic capacity of the bacterium to cause disease, based on the virulence and resistance traits it possesses. Unfortunately, E. coli can easily acquire this capacity and is considered a major cause of human infectious disease worldwide. In order to better understand the double component of the pathogenicity of E. coli, it is important to accurately define two concepts: virulence and resistance. Virulence is the pathogenic ability to cause damage in a host and is mediated by the expression of combined virulence factors. Resistance is the capacity to persist and grow in a determinate environment taking into account different variables such as temperature, pH conditions or antimicrobial concentrations. The antimicrobial resistance of E. coli is a worrisome aspect, which is very important and difficult to manage. This PhD dissertation is focused on the study of the molecular bases of the most prevalent antimicrobial resistance mechanisms in E. coli as well as the prevalence of different VFGs in various intestinal and extraintestinal E. coli infections in order to better understand the pathogenic aspects of this bacterium in human hosts.
- TesiBases biológicas de la fisiopatología y la farmacología del trastorno obsesivo-compulsivo de inicio en la infancia y la adolescencia. Influencia de la genética y la desregulación inmunológica(Universitat de Barcelona, 2018-03-02) Rodríguez Ferret, Natalia; Gassó Astorga, Patricia; Morer Liñán, Astrid; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] El trastorno obsesivo compulsivo (TOC) de inicio en la infancia y la adolescencia es un trastorno psiquiátrico con una prevalencia de alrededor del 1-3%, caracterizado por la presencia de obsesiones y compulsiones recurrentes que generan una elevada ansiedad y malestar en el paciente. Además, el debut temprano de estos pacientes conlleva un mayor riesgo de cronificación y un peor pronóstico. El conocimiento actual sobre los factores de riesgo y los mecanismos etiopatogénicos del TOC continúa siendo limitado. Una de las hipótesis más recientes plantea que las alteraciones en el sistema inmunitario podrían estar implicadas en el desarrollo de esta enfermedad. En cuanto al abordaje terapéutico, el principal tratamiento farmacológico utilizado en estos pacientes es la fluoxetina. A pesar de su eficacia en el control de la sintomatología obsesivo-compulsiva, existe una elevada variabilidad interindividual en la respuesta terapéutica. La presente tesis doctoral tiene como objetivo profundizar en las bases biológicas implicadas en la susceptibilidad a padecer TOC de inicio en la infancia y la adolescencia, centrándose en el papel que juegan los factores genéticos y las alteraciones inmunológicas, con el objetivo final de identificar nuevas dianas terapéuticas. Además, se pretende evaluar la influencia de los factores genéticos en la respuesta al tratamiento con fluoxetina en niños y adolescentes, con el fin de mejorar el tratamiento farmacológico actual. Los resultados obtenidos indican la presencia de alteraciones en el sistema inmunitario a distintos niveles en los niños y adolescentes con TOC. En concreto, estos pacientes presentan una frecuencia superior de determinados alelos HLA de clase II, así como una mayor concentración de monocitos circulantes proinflamatorios en comparación con individuos control. Además, estos monocitos en cultivo liberan mayores cantidades de citoquinas proinflamatorias y presentan un perfil de expresión en genes relacionados con el sistema inmunitario distinto al de los controles. En cuanto a la farmacogenética de la fluoxetina, variantes genéticas y epigenéticas en genes relacionados con el sistema serotoninérgico (HTRB1 y TPH2) parecen tener un efecto importante en la respuesta terapéutica. Los hallazgos obtenidos proporcionan nuevas evidencias sobre la fisiopatología y la farmacología del TOC, útiles para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y para la mejora del tratamiento farmacológico actual.
- TesiAplicación de modelos bayesianos para estimar la prevalencia de enfermedad y la sensibilidad y especificidad de tests de diagnóstico clínico sin gold standard(Universitat de Barcelona, 2016-11-17) Pereira da Silva, Hélio Doyle; Ascaso Terrén, Carlos; Abellana Sangrà, Rosa Mari; Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics[spa] Dos objetivos claves de la investigación diagnóstica son estimar con exactitud y precisión la prevalencia de la enfermedad y la sensibilidad y especificidad de tests diagnósticos. Se han desarrollado modelos de clases latentes que tienen en cuenta la correlación entre las medidas de los individuos determinadas con diferentes tests con el fin de diagnosticar enfermedades para las cuales no están disponibles tests gold standard. En algunos estudios clínicos, se hacen varias medidas del mismo individuo con el mismo test en las mismas condiciones y, por tanto, las mediciones replicadas para cada individuo no son independientes. En esta tesis se propone una extensión Bayesiana del modelo de clases latentes de efectos aleatorios de Gauss para ajustar a los datos de tests con resultados binarios y con medidas replicadas por individuo. Se describe una aplicación que utiliza los datos recogidos de personas infectadas por parásitos intestinales Hookworm llevada a cabo en el municipio de Presidente Figueiredo, Estado de Amazonas en Brasil. Además, a través de un estudio de simulación se comparó el desempeño del modelo propuesto con los modelos actuales (el modelo de efectos aleatorios individuo y modelos de dependencia e independencia condicional). Como era de esperar, el modelo propuesto presenta una mayor exactitud y precisión en las estimaciones de prevalencia, sensibilidad y especificidad. Para un control adecuado de las enfermedades la Organización Mundial de la Salud ha propuesto el diagnóstico y tratamiento de la infección tuberculosa latente (LTBI) en grupos de riesgo de desarrollar la enfermedad, como los niños. No existe un test gold standard para el diagnóstico de la infección latente. Los modelos estadísticos basados en la estimación de clases latentes permiten la evaluación de la prevalencia de la infección y la validez de los tests utilizados en ausencia de un gold standard. Se realizó un estudio transversal con niños de hasta 6 años de edad que habían sido vacunados con la BCG en Manaus, Amazonas-Brasil. El objetivo de dicho estudio fue estimar la prevalencia de la infección latente en los niños pequeños en contacto con un caso indice de tuberculosis en el hogar (TB-HCC) y determinar la validez y la seguridad del test cutáneo de tuberculina (TST) y QuantiFERON-TB Gold-in-tube (QFT), utilizando modelos de clases latentes. Para las estimaciones, en una primera fase se consideró la correlación entre los dos tests, y en la segunda fase se consideró la prevalencia en función de la intensidad y del tiempo de exposición. El cincuenta por ciento de los niños con TB-HCC tenía LTBI, con la prevalencia en función del tiempo y la intensidad de la exposición al caso índice. La sensibilidad y la especificidad de TST fueron del 73 % [intervalo de confianza del 95 % (IC): 53-91] y el 97 % (IC del 95 %: 89-100), respectivamente, frente al 53 % (IC del 95 %: 41-66) y el 81 % (IC del 95 %: 71-90) para QFT. El valor predictivo positivo de TST en niños con TB-HCC fue del 91 % (IC del 95 %: 61-99), y para QFT fue del 74 % (IC del 95 %: 47-95). Este es uno de los primeros estudios que usa modelos de clases latentes para estimar la prevalencia de la infección por M. tuberculosis en niños y los parámetros de sus principales tests diagnósticos. Los resultados sugieren que los niños en contacto con un caso índice tienen un alto riesgo de infección. La validez y los valores predictivos no mostraron diferencias significativas según el test aplicado. El uso combinado de los dos tests en nuestro estudio mostró una sutil mejoría en el diagnóstico de la LTBI.