Tesis Doctorals - Departament - Ciències Fisiològiques

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/106006

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 22

Insights into the role of GPRC5B in the pathophysiology of MLC disease
(Universitat de Barcelona, 2023-04-20) Pla Casillanis, Adrià; Estévez Povedano, Raúl; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Megalencephalic Leukoencephalopathy with Subcortical Cysts (MLC) is a rare genetic disorder characterized by macrocephaly and white matter vacuole formation. The pathogenesis of this disease is suggested to be due to an impaired water and ionic homeostasis by glial cells. MLC disease is caused by mutations in either MLC1 or GLIALCAM genes. They encode for membrane proteins that form a complex in astrocytes, although its exact function is still unclear. GlialCAM has also been reported to act as the auxiliary subunit of the chloride channel ClC-2. In addition, recent studies also identified the G-protein-coupled receptor GPRC5B as an important member of the GlialCAM/MLC1 interactome and relevant to the regulation of related physiological processes. The main objective of this thesis is to determine the role of GPRC5B and signaling events in MLC pathophysiology. We characterized that GPRC5B regulates the expression of a novel GlialCAM/MLC1 interacting protein, Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1). Also, we proved that this regulation is dependent on Fyn kinase activity via GPRC5B, and that MLC1 has a negative modulatory effect on this regulation. We also showed that GlialCAM forms oligomeric structures at the plasma membrane of astrocytes via lateral interactions between IgC2 domains from adjacent GlialCAM proteins. Moreover, we propose that mutations in GLIALCAM that encode for residues that are located in GlialCAM IgC2 domain are pathogenic because they increase the stability of GlialCAM oligomeric structures. We give evidence that this endocytosis is physiologically mediated by GPRC5B. Furthermore, we show that phosphorylation events are important in the regulation of the activity of chloride channels within GlialCAM/MLC1 interactome. We observed that GPRC5B has a negative modulatory effect on volume-regulated anion channel (VRAC) activity via Fyn. Last, we identified dephosphorylation events in specific Serine residues in ClC-2 as triggers of the described changes in the subcellular localization of the channel, together with altered gating properties, that occur in astrocytes in depolarizing conditions.
Molecular Mechanisms of the Ubiquitin Ligase HERC2 in Cell Signalling: Implications in Cellular Stress, Autophagy and Proteasome Assembly
(Universitat de Barcelona, 2023-12-03) Sala Gastón, Joan; Rosa López, José Luis; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Ubiquitylation is a posttranslational modification that consists in the attachment of ubiquitin to a substrate protein. During the process of ubiquitylation, the E3 ubiquitin ligases determine the specificity of the substrates, thus, they represent a crucial regulatory factor. Among them is the ubiquitin ligase HERC2, which belongs to the Large HERC protein family. HERC2 has been extensively studied for its implication in the regulation of genomic stability and p53 transcriptional activity. However, its involvement in other signalling pathways in which ubiquitylation also plays an important role remains fairly unexplored. Regarding the clinical relevance of HERC2, mutations in HERC2 gene in humans have been related to different pathologies such as a neurodevelopmental disorder known as HERC2 Angelman-like syndrome and several types of cancers. A better understanding of how pathologic HERC2 mutant variants affect intracellular signalling may aid definition of potential new therapies for these disorders. In view of all this, the main objective of this thesis was to study the signalling pathways regulated by HERC2 and to characterize the molecular mechanisms behind. We focused on the MAPK and autophagy pathways, and analysed how these are deregulated in pathological contexts of HERC2 deficiency. For that, we studied patient-derived fibroblasts of individuals with the HERC2 Angelman-like syndrome, which present a marked reduction in HERC2 protein levels. We complemented the investigations using other human and mouse cellular models by knocking down HERC2 protein expression. On the other hand, we applied a proteomic approach to identify ubiquitylated proteins regulated by HERC2, which can help to unveil novel physiological functions of this ubiquitin ligase. First, we studied MAPK signalling pathways in the patient-derived fibroblasts and observed increased levels of C-RAF protein and p38 phosphorylation. We showed that this occurs due to the fact that HERC2 regulates ubiquitin-mediated proteasomal degradation of C-RAF. Thus, in a context of HERC2 deficiency, C-RAF protein levels are upregulated. We found out that this upregulation triggers overactivation of a crosstalk between C-RAF and MKK3/p38 signalling pathways, which boosts the cellular response to oxidative stress through NRF2 and the expression of antioxidant genes. Secondly, we focused on autophagy and observed that it was increased in HERC2 deficient cells. Moreover, we demonstrated that HERC2 regulates protein levels of the autophagy initiating kinase ULK1 and the deubiquitinating enzyme USP20, which stabilizes ULK1. Additionally, we showed that HERC2 interacts with USP20, and observed that this interaction is disrupted upon p38 phosphorylation. Taken together these results suggested that HERC2 regulates autophagy through modulating USP20/ULK1 axis and that this process might be fine-tuned by p38 activity. In third place, we applied a proteomic approach to identify potential HERC2 ubiquitylation substrates. Results showed a functional enrichment of proteins related with the proteasome assembly pathway such as PSMC5 and PAAF1. We further confirmed that HERC2 interacts with these proteins in pull-down experiments. Finally, we discussed the molecular mechanisms of HERC2 in the regulation of MAPK signalling, autophagy and the proteasome assembly pathway, trying to postulate a working model that adds the results obtained to the knowledge stablished so far in the scientific literature. In addition, we inquired about how these mechanisms fit with the pathophysiology of the HERC2 Angelman-like syndrome and cancer. In conclusion, throughout this work we revealed previously unexplored functions of the ubiquitin ligase HERC2 in cell signalling. In particular, we described HERC2 as a regulator of: 1) the cellular response to oxidative stress through the C-RAF/MKK3/p38 pathway; 2) autophagy through the USP20/ULK1 axis; and 3) the proteasome assembly pathway through regulating ubiquitylation of proteins such as PSMC5 and PAAF1.
Insights into MLC pathophysiology: a biochemical and structural approach
(Universitat de Barcelona, 2024-12-10) Ferigle Burgada, Laura; Estévez Povedano, Raúl; Errasti-Murugarren, Ekaitz; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a rare type of leukodystrophy characterized by macrocephaly and white matter vacuolation. The pathogenesis of the disease is suggested to be caused by an impaired water and ionic homeostasis by glial cells. MLC is caused by mutations in MLC1, GLIALCAM, GPRC5B and AQP4. MLC1 and GLIALCAM encode for membrane proteins that form a complex in astrocytes, whose exact function remains unclear. Following studies identified the G- protein-coupled receptor GPRC5B as an important member of the GlialCAM/MLC1 interactome and relevant to the regulation of related physiological processes. One of the main objectives of this thesis is to determine the role of GPRC5B and its signalling activity related to the pathophysiology of MLC. We determine that MLC1 has a negative modulatory effect on GPRC5B signalling pathways. Besides, we propose that mutations in GLIALCAM that encode for residues located in GlialCAM IgC2 domain are pathogenic due to the increased stability of GlialCAM oligomeric structures. Moreover, we give evidence that GlialCAM endocytosis is mediated by GPRC5B. We also study the recent identified mutations in GPRC5B known to cause MLC and observe a resistance to internalization resulting in the same outcome as those GlialCAM IgC2 mutations. Another objective of this thesis is to obtain the tridimensional structure of MLC1. We have achieved a preliminary structure of homo-trimeric MLC1 at a resolution of 7 Å, approximately. At the same time, we have developed nanobodies that specifically recognize MLC1 to help orientate particles during cryo-electron microscopy (cryo-EM).
Physiological relevance of the E3 ubiquitin ligase HERC1
(Universitat de Barcelona, 2022-12-02) Martínez Martínez, Arturo; Rosa López, José Luis; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] HERC1 es una E3 ubicuitina ligasa de la familia HECT. Mutaciones en el gen de HERC1 han sido relacionadas con diferentes tipos de cánceres y enfermedades neurodegenerativas. En esta tesis, demostramos que HERC1 también juega un papel importante en la homeostasis ósea, ya que su ausencia en ratones provoca osteopenia progresiva a causa de la estimulación de la reabsorción ósea. Además, también probamos que HERC1 regula el metabolismo y el balance energético, ya que ratones knock-out para este gen presentan una clara deficiencia en la actividad termogénica y un incremento de la adiposidad general. Por otro lado, también describimos alguna afectación cardíaca a consecuencia de la falta de HERC1. Estos datos establecen una primera caracterización de la relevancia fisiológica de HERC1 como regulador de la homeostasis ósea y adiposa y del balance energético, y de su potencial rol en otros tejidos como el miocardio.
Targeting mitochondrial metabolism in cancer: development and validation of PEPCK-M and PYCR1 inhibitors
(Universitat de Barcelona, 2022-06-30) Aragó Belenguer, Marc; Perales Losa, Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] La reprogramación metabólica es uno de los procesos que caracterizan el cancer. Estos cambios en el metabolismo de las células tumorales no solo permiten a las células obtener los metabolitos necesarios para su continua proliferación, sino que también participan activamente en otros procesos esenciales para la progresión del cancer (señalización oncogénica, evasión del sistema inmune, angiogénesis, etc.). No obstante, estos cambios también provocan ciertas dependencias y vulnerabilidades metabólicas que pueden ser el objetivo de tratamientos farmacológicos. PEPCK-M y PYCR1 son dos enzimas, de la gluconeogénesis y de la biosíntesis de prolina respectivamente, que están sobre expresadas en diferentes tipos tumorales y que juegan un papel importante en la biología del cancer. Debido a su importante rol en las células tumorales, nosotros y otros autores proponemos que ambas enzimas son dianas terapéuticas emergentes para el tratamiento del cancer. El objetivo de esta tesis doctoral es el diseño y validación de inhibidores específicos para PEPCK-M y PYCR1, así como el estudio de los mecanismos por los que estas enzimas participan en la progresión de la enfermedad. Para ello, hemos usado un enfoque multidisciplinar combinando técnicas computacionales (como el docking molecular o las simulaciones de dinámicas moleculares) e experimentales (ensayos in vitro, en líneas celulares de cancer e in vivo con modelos animales). El inhibidor de la isoforma citosólica de PEPCK iPEPCK-2, inhibió PEPCK-M con una potencia similar. El tratamiento con iPEPCK-2 redujo el crecimiento de células cancerígenas y su viabilidad en deprivación de glucosa. Además, inhibió el crecimiento de tumores insertados en ratones. Validando así PEPCK-M como diana terapéutica y iPEPCK-2 como inhibidor de PEPCK-M con actividad antineoplásica. Mediante un cribado virtual identificamos varias moléculas con actividad inhibitoria de PYCR1 (con una IC50 < 200 µM). Los modos de unión de estos compuestos fueron predichos usando simulaciones de dinamica molecular. Después de un proceso de optimización racional se obtuvieron compuestos con actividades de hasta 30 µM. Interesantemente estos compuestos inhibieron la proliferación de líneas celulares de cancer de mama y colon de forma dosis-dependiente. Así pues, el descubrimiento de estos inhibidores de PYCR1 plantea un escenario favorable para su optimización hasta un candidato a fármaco.
White adipose tissue characterization and lipid profiling in obesity
(Universitat de Barcelona, 2022-07-27) Dahdah, Norma; García-Roves, Pablo M. (Pablo Miguel); Malagón Poyato, María del Mar; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Obesity has become exceedingly pervasive, a resultant of amplified food availability and reshaped human behavior stimulated by urbanization. It poses as a major challenge for human metabolic physiology testing the limitations of metabolic plasticity; an adaptive capacity against internal or environmental stressors. A stressor persisting and turning into a chronic situation, diminishes the ability to adapt, thus debilitating metabolic plasticity. In the face of the various strategies for combatting obesity, it has become increasingly crucial to further advance the understanding of obesity-associated metabolic adaptations at a systemic and a tissue-specific level. Committed towards this purpose, the LiMa (Lifestyle Matters) project aimed at an integrative multidisciplinary approach addressing phenotypical and functional transitions induced by obesity and weight loss. A combined nutritional and exercise intervention was implemented on a mouse model of diet-induced obesity in order to evaluate metabolic plasticity and interpret the crosstalk among tissues and its manifestation systemically. An assessment of several parameters, systemically and in major tissues dictating metabolic responses, revealed an impressive capacity to overcome the impairment induced by obesity. However, a lack of plasticity emphasized by a deteriorating mitochondrial function in epididymal white adipose tissue (eWAT) was evident in our study. The aim of this doctoral thesis is to gain further insight on metabolic plasticity of formerly obese mice by adding on to the description of the phenotypes of the experimental groups and by focusing on different depots of white adipose tissue and their stromal vascular fraction. A lipidomic study identified lipid profiles as tissue specific, and reported lipidomes of liver and skeletal muscle reflective of energy balance contrary to eWAT lipidome, which was reflective of the content of the administered diet. With the attention shifted towards adipose tissue, eWAT seemed to be more susceptible than the other adipose tissue depot investigated – subcutaneous white adipose tissue (sWAT) – to damage initiated by high-fat feeding. This vulnerability was highlighted by an intense inflammatory profile, as indicated by the M1 proinflammatory phenotype of infiltrating macrophages in eWAT and the presence of crown-like structures surrounding adipocytes, together with worsening of mitochondrial function of adipose-derived stem cells in eWAT. Moreover, other macrophage subtypes seem to participate in eWAT expansion and remodeling, including M2a macrophages induced by HFD, which are involved in endocytic processes, as well as M2b macrophages, controlling the intensity of inflammatory reactions, and M2c macrophages, involved in the phagocytosis of apoptotic adipocytes. eWAT remodeling also involved significant changes in the composition and appearance of the extracellular matrix, with HFD increasing the expression of both collagens and proteoglycans involved in fibrosis, such as COL1, COL3 or COL6, and lumican and versican, respectively. Notably, intervention studies aimed at reducing body weight (exercise and decreased feeding) reverted, though only partially, the matrisome of eWAT while the macrophage population recovered the original, lean phenotype upon weight loss. Hence, data from previous LiMa studies combined with data from this doctoral thesis illustrate visceral white adipose tissue as the most affected tissue in the progression of obesity. In addition, the deterioration in its mitochondrial function despite improvements in tissue morphology hints at mitochondrial health as a key determinator of the state of metabolic plasticity.
Nutrient supply impacts osteocytic specification by regulating a nuclear transcription program
(Universitat de Barcelona, 2021-01-28) Sánchez de Diego, Cristina; Ventura Pujol, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] El hueso es un órgano con múltiples funciones. No sólo actúa como elemento de soporte, protección y locomoción, sino que también resulta indispensable en el mantenimiento del equilibrio mineral y ácido/base, conforma un nicho adecuado para el desarrollo de la hematopoyesis, y mantiene la homeostasis energética del organismo. En estos procesos, los osteocitos tienen un papel especialmente relevante, ya que actúan transduciendo estímulos mecánicos en señales bioquímicas. Los osteocitos constituyen el principal componente celular óseo. Derivan de osteoblastos, los cuales a su vez proceden de células madre mensenquimales (MSC). Los osteoblastos pueden seguir tres destinos alternativos: entrar en apoptosis, originar células de revestimiento óseo o progresar en la diferenciación hacia osteocitos. Actualmente, los estímulos y vías de señalización que regulan cada uno de estos procesos son desconocidos. Por ello, y teniendo en cuenta la importancia de los osteocitos en la homeostasis del organismo, consideramos necesario profundizar en su investigación. Durante el proceso de diferenciación ósea, los osteoblastos quedan embebidos en una matriz mineralizada que limita su disponibilidad de nutrientes, estando expuestos a un ambiente hipoglucémico al cual deben adaptarse. En este contexto Wei et al. demostraron que la glucosa juega un papel importante en la regulación de la diferenciación osteoblástica. Por otro lado, se ha observado que, en ambientes hiperglucémicos, típicos de pacientes diabéticos, se produce una reducción del número y función osteoblástica, así como una disminución de la densidad mineral ósea y alteración de la microarquitectura ósea. Teniendo en cuenta todo lo expuesto, estudiamos la capacidad de diferenciación de las IDG-SW3 en condiciones de hipoglucemia (1mM glucosa), normoglucemia (5mM glucosa) o hiperglucemia (25mM glucosa). Las condiciones de hipoglucemia promueven la diferenciación osteocitica, mientras que altas concentraciones de glucosa dificultan este proceso. A nivel metabólico, las condiciones de baja glucosa aumentan la cantidad de mitocondrias y su agrupación en forma de redes. Por otro lado, los ambientes hipoglucémicos, promueven los eventos de fisión mitocondrial. En este contexto PGC1α podría desempeñar un papel crucial como nexo entre el estrés metabólico y la reprogramación génica de los osteoblastos. PGC1α es un coactivador transcripcional que responde a diferentes tipos de estrés. Aunque sus dianas son múltiples, afectan principalmente a la expresión de genes implicados en el metabolismo, así como la biogénesis y función mitocondrial. PGC1 se activa a través de fosforilación y acetilación mediadas por AMPK y SIRT1. La activación de PGC1α, podría iniciar una reprogramación metabólica y génica que culminaría en una inducción de la diferenciación osteocítica.
Anàlisi bioquímica de l’interactoma de MLC1 i GlialCAM: impacte en la Leucoencefalopatia Megalencefàlica
(Universitat de Barcelona, 2021-12-18) Alonso Gardón, Marta; Estévez Povedano, Raúl; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] El propòsit principal d’aquesta tesi és obtenir nous coneixements sobre la fisiopatologia de la Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC, de l’anglès Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcorticals Cysts), un tipus de leucodistròfia genètica causada per mutacions en els gens de MLC1 o GLIALCAM. Aquest treball té l’objectiu d’aprofundir en el paper fisiològic de les proteïnes MLC1 i GlialCAM, a partir de la identificació de la seva xarxa de proteïnes d’interacció i de l’estudi de la modulació dels canals de clorur en els astròcits. En la introducció, en primer lloc es resumeixen les principals característiques genotípiques i fenotípiques de la malaltia MLC, i les seves proteïnes implicades, concretament MLC1 i GlialCAM. Posteriorment, es proporciona una visió exhaustiva de la fisiologia dels astròcits, les cèl·lules principalment implicades en la malaltia, amb un focus especial en la descripció dels canals de clorur ClC-2 i VRAC. I per últim, es dona una descripció general sobre les característiques principals dels receptors acoblats a proteïna G (GPCR, de l’anglès G protein-coupled receptors) i la implicació en el mecanisme de la regulació del volum cel·lular. De manera més detallada, es descriuen les funcions dels receptors orfes GPR37, GPR37L1 i GPRC5B en el sistema nerviós central (SNC), degut a la seva potencial implicació en la malaltia MLC.
Relació estructura-funció de les proteïnes implicades en la leucoencefalopatia megalencefàlica amb quists subcorticals
(Universitat de Barcelona, 2021-12-17) Xicoy Espaulella, Efren; Estévez Povedano, Raúl; Errasti-Murugarren, Ekaitz; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[cat] La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (de l’anglès Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts, MLC) és un tipus rar de leucodistròfia caracteritzada per la presència de vacuoles en la substància blanca del sistema nerviós. Es suggereix que la patogènesi de la malaltia és causada pel mal funcionament de les cèl·lules glials en el control de la homeòstasi iònica i el fluid cerebral. Els gens responsables de la malaltia són MLC1 i GLIALCAM que codifiquen per dues proteïnes que reben el mateix nom i que actualment es desconeix la seva funció biològica i la seva estructura. Ambdues proteïnes formen un complex a la membrana plasmàtica que s’expressa principalment en els astròcits que envolten la barrera hematoencefàlica i a la glia de Bergmann del cerebel. Es coneix que aquest complex regula de manera directa a varis canals iònics i transportadors involucrats en el control del flux de ions i de l’aigua en les cèl·lules glials, afectant la seva localització i funció; i indirectament a través de vies de senyalització. El principal objectiu d’aquesta Tesi és augmentar el coneixement estructural d’ambdues proteïnes amb la finalitat d’entendre la seva funció biològica i el mecanisme patològic de la malaltia.
Evaluación funcional y daño progresivo en el sistema vestibular
(Universitat de Barcelona, 2022-01-24) Maroto Ferrer, Alberto; Llorens i Baucells, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] Esta tesis ha establecido la relación entre la función vestibular valorada a partir de los reflejos vestibulares anti gravitacionales air‐right y tail‐lift con el número de células ciliadas de tipo I (HCI) y II (HCII) en los epitelios sensoriales tras lesiones ototóxicas por IDPN. Los resultados demostraron una mayor sensibilidad de las HCI en comparación con las HCII a la ototoxicidad, así como una resistencia relativa del sáculo en comparación con la cresta y el utrículo. Comparando las medidas funcionales con los recuentos de células, se observó que la pérdida del reflejo de tail‐lift se asocia mejor con la población de HCI que con la de HCII. Por el contrario, la mayor parte de las HCI en la cresta y el utrículo se perdieron antes de que aumentaran los tiempos de air‐right. Por lo tanto, los datos sugieren que estos reflejos dependen de la función de poblaciones no idénticas de HC vestibulares. En esta tesis también se ha realizado el desarrollo y la caracterización de modelos de toxicidad vestibular crónica por estreptomicina en rata. En dos modelos diferentes, con una o dos inyecciones diarias de estreptomicina, se ha podido demostrar que las primeras fases de la toxicidad causada por su exposición crónica son similares a las demostradas por el tóxico experimental IDPN. Ésta se caracteriza por la pérdida de adhesión entre las células ciliadas y las terminales adyacentes, incluyendo un desacoplamiento sináptico. Además, la fase inicial se asocia al inicio de la pérdida funcional, y es reversible. También se ha demostrado en estreptomicina que, en caso del mantenimiento del estrés tóxico, se produce una pérdida de células ciliadas mediante, al menos parcialmente, por extrusión. Por otro lado, se ha estudiado que en algunos epitelios vestibulares humanos expuestos a situación de estrés, concretamente por la presencia de un schwannoma vestibular cercano, hay también una pérdida de adhesión celular de las células ciliadas con las aferentes. Por último, se han obtenido datos de RNA‐seq para estudiar los efectos de la toxicidad crónica sobre la expresión génica en epitelios y ganglios vestibulares, comparando los diversos modelos disponibles (IDPN‐rata, IDPN‐ratón, estreptomicina‐rata). La finalidad ha sido identificar los principales programas de expresión génica implicados en la respuesta de los tejidos vestibulares a la agresión tóxica crónica. Posteriormente, se ha recogido numerosos datos de RT‐PCR y de inmunohistoquímica para corroborar e interpretar los resultados de RNA‐seq.
Desarrollo de metodologías citómicas avanzadas aplicadas al diagnóstico de hemopatías
(Universitat de Barcelona, 2022-01-18) Bardina Santos, Jorge; Pétriz González, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] El objetivo principal de esta Tesis es demostrar el potencial de la citometría de flujo para la transferencia del laboratorio de investigación a la clínica, que se encuentra a diferentes niveles: el primer nivel es metodológico, especialmente mediante los métodos de mínima manipulación de la muestra. En el segundo nivel se encuentra la adaptación de otras técnicas a la citometría de flujo. En el tercer nivel se demuestran las ventajas de la implementación de tecnologías en pruebas clínicas. Y, en el cuarto nivel la validación de nuevas herramientas diagnósticas para el diagnóstico de enfermedades hematológicas y del sistema inmunitario. Para demostrar los diferentes niveles de transferencia de la citometría de flujo, se han realizado cuatro estudios con objetivos concretos: Del primer estudio: Demostrar las ventajas y aplicabilidad de metodologías que permiten la mínima manipulación posible de las muestras biológicas y sus ventajas para identificar células patológicas. Del segundo estudio: Aplicar la transferencia de la citometría de flujo sobre el método citoquímico de la determinación de la actividad fosfatasa alcalina granulocitaria, mediante la mínima manipulación de las muestras para detectar dicha actividad en su estado nativo a nivel celular. Del tercer estudio: Demostrar que la determinación de progenitores hematopoyéticos CD34+ puede realizarse con mayor precisión gracias a la utilización de sistemas volumétricos reales y excitación con láseres de 561 nm como estrategia de implementación de las recomendaciones ISHAGE. Del cuarto estudio: Otorgar la acreditación CE-IVD a una larga serie de anticuerpos monoclonales para su posterior utilización en procedimientos de diagnóstico clínico.
Not to be picky: PEPCK-M ensures metabolic flexibility in cancer cells and neuronal progenitors
(Universitat de Barcelona, 2017-05-26) Hyroššová, Petra; Perales Losa, Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is an enzyme that catalyses decarboxylation of oxaloacetate to phosphoenolpyruvate and it is part of gluconeogenic/glyceroneogenic pathway. There are two known isoforms of PEPCK, the mitochondrial and the cytosolic isozyme that are catalysing chemically identical reactions, but they differ in regulation and expression pattern. Selective presence of mitochondrial isoform of this enzyme (PEPCK-M, PCK2) in all types of cancer examined and in cycling neuroprogenitors, suggests a functional relationship with the metabolic adaptations of these cells. This thesis has had as its main objectives the characterization of the role of PEPCK-M in tumour cells and in neuronal progenitor cells. Metabolism of cell in CNS is not completely elucidated yet. Here we demonstrate that Tbr2 positive neuronal progenitors are metabolically dependent on lactate, which is favouring maintenance of their undifferentiated state. Lactate as metabolite can feed anabolic pathways and sustain ATP production by its oxidation in the TCA cycle. However, essential pathways like PPP, glycerol synthesis or one carbon metabolism pathways require carbons to feed the glycolytic intermediate pool. PEPCK-M in this setting, with lactate as sole carbon source is the only known pathway to fulfil the above-mentioned anabolic requirements. By using inhibitor of PEPCK-M we were able to prove that Tbr2 positive neuronal progenitors are metabolically dependent on PEPCK-M activity and their number significantly decrease after inhibiting PEPCK-M in vitro and in vivo. PEPCK-M activity in tumour cells is necessary for survival and growth in 2D and in cultures on semi-solid agar (anchorage-independent growth), which suggests that this enzyme has a fundamental role in the survival program to cell stress. A Kaplan-Meier analysis from datasets available in the GEO database (> 5000 patients) shows that elevated PCK2 expression is significantly associated with a worse prognosis in patients with breast cancer. Despite its potential relevance for metabolic adaptations in cancer, the mechanisms responsible for its pro- survival activity are not known. Therefore, we have proposed to study these mechanisms through metabolomic analysis where we wanted to examine whether PEPCK-M feeds an alternative pathway to glucose using carbons from glutamine in an experimental model with reduced and overexpressed levels of PEPCK-M activity. We demonstrated the functionality of PEPCK-M driven cataplerosis in MCF7 cells grown under glucose deprivation by showing synthesis of serine and glycine from glutamine by observing contribution of 13C-labeled carbons from [U-13C] glutamine into these metabolites. In the absence of nutritional stress (high abundance of glucose and amino acids), the silencing of PEPCK-M induces oxidative stress and the accumulation of succinate, with the consequent induction of p21 and deficiencies in cell growth. Glutamine cataplerosis is not affected by alterations in PEPCK-M activity. However, a higher enrichment of all carbons with 13C in intermediates of the Krebs cycle (TCA cycle) suggests a reduction in flux through this pathway. Together, these data increase our understanding of metabolic adaptations in tumours and the role of PEPCK in providing alternative carbon fluxes to deal with nutritional stress. Finally, these studies allow us to propose PEPCK-M as a new target for the treatment of tumorigenic processes that will need to be validated in the future.
Defectos en la reparación homóloga producen un aumento del metabolismo oxidativo en cáncer de ovario: relevancia para los tratamientos con inhibidores de PARP
(Universitat de Barcelona, 2020-10-29) Lahiguera Belenguer, Álvaro; Viñals Canals, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[spa] Hipótesis: ¿El daño crónico en el ADN o bloqueo de la HR crónico produce un shift o una selección de células que han cambiado su metabolismo para poder sobrevivir a la situación? Objetivos: El principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido estudiar la correlación entre los defectos de reparación en la recombinación homóloga o daño crónico en el ADN y la adaptación metabólica que se lleva a cabo para poder sobrevivir en esa situación en el cáncer de ovario seroso de alto grado. Como objetivos concretos de la tesis tenemos: A) Generación y caracterización de modelos que padezcan daño crónico en el ADN o sufran defectos en la reparación por recombinación homóloga. B) Estudiar los mecanismos de adaptación metabólica de estos modelos celulares al daño crónico y los fallos en la recombinación homologa C) Ver el papel que pueden jugar inhibidores de la cadena respiratoria como posibles tratamientos a tumores de estas características y las interacciones con otros tratamientos que se utilizan actualmente.
Genetic and biochemical approaches to decipher the molecular basis of the pathology in LCA12 and RP10 retinal dystrophies
(Universitat de Barcelona, 2020-05-15) Plana-Bonamaisó, Anna; Méndez Zunzunegui, Ana; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] The main aim of this work was to characterize the molecular mechanisms that underlie the physiopathology of LCA12 and RP10, that are inherited retinal dystrophies caused by alterations in guanine nucleotide metabolism. First, LCA12 is caused by loss-of-function mutations in the retinal degeneration 3 (RD3) gene, that impair rod and cone function and cause a fast retinal degeneration in patients. This disease is reproduced in the natural strain of rd3 mice. The underlying physiopathology mechanisms of LCA12 are not well understood. We previously proposed that Guanylate Cyclase Activating Proteins (GCAPs) might be key Ca2+-sensors mediating the physiopathology of this disorder, based on the demonstrated toxicity of GCAP2 when blocked in its Ca2+-free form at photoreceptor inner segments. We here show that the retinal degeneration in rd3 mice is substantially delayed by GCAPs ablation. While the number of retinal photoreceptor cells is halved in six weeks in rd3 mice, it takes eight months to halve in rd3/rd3 GCAPs-/- mice. Although this substantial morphological rescue does not correlate with recovery of visual function due to very diminished guanylate cyclase activity in rd3 mice, it is very informative of the mechanisms underlying photoreceptor cell death. By showing that GCAP2 is mostly in its Ca2+-free phosphorylated state in rd3 mice, we infer that the [Ca2+]i at rod inner segments is permanently low. GCAPs are therefore retained at the inner segments in their Ca2+-free, guanylate- cyclase-activator state. We show that in this conformational state GCAPs induce endoplasmic reticulum stress, mitochondrial swelling and cell death. ER stress and mitochondrial swelling are early hallmarks of rd3 retinas preceding photoreceptor cell death, that are substantially rescued by GCAPs ablation. By revealing the involvement of GCAPs-induced ER stress in the physiopathology of LCA12 this work will aid to guide novel therapies to preserve retinal integrity in LCA12 patients to expand the window for gene therapy intervention to restore vision. Second, RP10 is caused by gain-of-function mutations in IMPDH1 gene. Inosine-5´-monophosphate dehydrogenase 1 (IMPDH1) catalyzes the rate-limiting step in the de novo synthesis of guanine nucleotides, impacting the cellular pools of GMP, GDP and GTP. Guanine nucleotide homeostasis is central to photoreceptor cells of the retina, where cGMP is the signal transducing molecule in the light response. Mutations in IMPDH1 lead to inherited blindness, but the physiological relevance of IMPDH1 in the retina or its in vivo regulation remain largely unknown. We here investigate the in vivo regulation and physiological relevance of IMPDH1 in the retina, to gain insight into how IMPDH1 mutations lead to retinal dystrophies. We here report that retinal IMPDH1 in vivo is regulated by light- dependent phosphorylation at Thr159/Ser160 in the Bateman domain by protein kinase C, that desensitizes the enzyme to allosteric inhibition by GDP/GTP. The projected enhancement in guanine 15 nucleotide synthesis would contribute to sustain the GTP levels during illumination. Accordingly, we show that living mice accumulate IMPDH1 aggregates at rod outer segments upon prolonged bright light exposure; and that inhibiting IMPDH1 activity in living mice by intravitreal injection of IMPDH1 inhibitors delays rod mass response recovery. Based on these results we propose a novel mechanism of in vivo regulation of IMPDH1 that when disrupted leads to blindness.
Vestibular Damage and Repair in Chronic Ototoxicity: Cellular Stages, Physiological Deficits and Molecular Mechanisms
(Universitat de Barcelona, 2019-07-11) Greguske, Erin A.; Llorens i Baucells, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] Progressive ototoxicity of the inner ear is prevalent in patients administered aminoglycoside antibiotics with little understanding of how this damage occurs and to what extent it can be recovered. Numerous in vitro and in vivo studies using acute methods have been completed to demonstrate various types of damage in vestibular and auditory tissue, including hair cell damage that results in apoptosis or necrosis, excitotoxic damage, and/or degeneration of their afferents. However, progressive damage has only just recently been studied utilizing a sub-chronic exposure rat model; this model takes into account the progressive exposure mirrored in aminoglycoside administration that is not implied in acute experimentation. With this in mind, the sub-chronic exposure model was adapted for a new mouse model to characterize the progressive damage taking place in vestibular sensory epithelia and ganglia, along with a preliminary characterization in cochlear sensory epithelia. Mice were exposed to 30 mM IDPN (3,3’- iminodipropionitrile) in regular drinking water for 8 weeks, and monitored for vestibular deficits using an established test battery; auditory deficits were recorded using auditory brainstem response (ABR) measurements. Various techniques for identifying functional, histological (scanning/transmission electron microscopy; immunoconfocal), and molecular (mRNA; protein) data were utilized to study alterations in the vestibular and auditory tissues after sub-chronic intoxication. In the vestibular tissue, SEM/TEM imaging demonstrated progressive damage with the loss of calyceal junctions between type I hair cells and their calyx afferents, the fragmentation and retraction of the afferents, stereociliary bundle coalescence, and the unique mechanism of hair cell extrusion, where the cell is ejected from the epithelia into the endolymphatic cavity. Immunoconfocal and qRT-PCR data demonstrated a loss of caspr1 and tenascin-c in the calyceal junctions of type I hair cells and their afferents. A loss of active synapses between hair cells and their afferents was also noted, where active synapses were defined by the pre-synaptic ribeye of the hair cells and the post-synaptic GluA2 receptor of the afferents. Synaptic scaffolding protein expression was upregulated (PSD95, Homer1), which translated into an increase in the protein level (PSD95), likely for hair cell-afferent synapse stabilization and compensation. Progressive damage was noted to be at least partially or completely recoverable up until stereocilia coalescence of the hair cells. Finally, the expression of numerous scaffolding and signaling proteins were shown to be downregulated (qRT-PCR; RNAseq) during the exposure in the vestibular epithelium and ganglion, leading to the hypothesis of a depression in cell-cell adhesion between hair cells and their afferents and a depression in afferent signaling, resulting in an overall depressed system. In the cochlea, profound hearing loss was observed in a tonotopic pattern during the exposure; higher frequencies were affected first with longer exposure times affecting lower frequencies. Outer hair cells were lost tonotopically due to prolonged exposure, followed by active synapse loss of the inner hair cells. Those intoxicated for the first two weeks demonstrated a capacity for recovery before any outer hair cell or active synapse losses were seen. A sub-chronic ototoxic IDPN model demonstrates the progressive damage of the inner ear, allowing for the study of this damage and its potential for recoverability, gaining a clearer understanding of the mechanisms affecting the tissues.
Expressió del gen de la proteïna [alfa]B-cristal·lina: variabilitat dels trànscrits en Gallus domesticus
(Universitat de Barcelona, 1998-11-09) Macip, Salvador, 1970-; Mezquita Pla, Salvador; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[cat] La present Tesi recull els estudis que hem realitzat en el període 1994-1998 sobre l'expressió en el gall (Gallus gallus) del gen de la proteïna aB-cristal·lina. En la Introducció hem fet un repàs a les principals característiques d'aquesta proteïna per explicar què ens va induir a estudiar-la amb detall, aturant-nos especialment en les dades que ens han servit per a bastir les nostres hipòtesis. Els Objectius descriuen quines eren les preguntes que vam decidir respondre amb el nostre treball, que es descriu detalladament en I'apartat de Resultats. La Discussió debat una mica el possible significat d'aquests resultats tenint present tot el que s'ha dit en apartats anteriors. La secció de Mètodes és un recull de tots els protocols experimentals usats per obtenir els citats resultats. Finalment, les Conclusions resumeixen les dades que hem considerat més importants del treball realitzat.
Exploring the regulation and function of TIGAR in cancer cells
(Universitat de Barcelona, 2019-07-05) Simon Molas, Helga; Bartrons Bach, Ramon; Manzano Cuesta, Anna; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques
[eng] The TP53-Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator (TIGAR) gene was described in 2006 by Dr. Karen Vousden's group in response to the induction of the tumour suppressor gene p53. Since then, numerous studies have focused on clarifying the role of this gene in the metabolism of tumour cells. TIGAR was initially described as an enzyme with bisphosphatase activity on fructose-2,6-bisphosphate, a key metabolite in the positive allosteric regulation of phosphofructokinase-1, which catalyses a key reaction in glycolysis. Through this bisphosphatase activity, TIGAR reduces the levels of fructose-2,6-bisphosphate and, consequently, decreases the glycolytic flux and redirects the metabolites to the pentose phosphate pathway, which is determinant for the antioxidant capacity of cells. Overexpression of TIGAR has been described in multiple tumours, as well as in different cell lines, indicating that this gene confers a growth advantage to these cells. The present doctoral thesis has focused on studying the metabolic function of TIGAR in tumours, as well as the mechanisms that regulate its transcription. The study was carried out on cell lines of cervical cancer and lung cancer in which we have been able to confirm that TIGAR exerts a bisphosphatase function on fructose-2,6-bisphosphate. TIGAR has proven to be key in the response of the cervical cancer cell line HeLa to the blockage of glycolysis, either by inhibiting the expression of the PFKFB3 gene by interfering RNA technology, or by blocking the PFK-2 protein by the drug 3PO. The blockage of glycolysis increases oxidative stress and the phosphorylation of the kinase Akt, which is required for the induction of TIGAR. Furthermore, through metabolomic studies we have been able to describe for the first time the involvement of TIGAR in the entrance of pyruvate to the tricarboxylic acid cycle, in the mitochondria. Finally, and in relation to the mechanisms that regulate the transcription of TIGAR, we have proved that the transcription factor Nrf2, key in the regulation of the antioxidant activity of tumour cells, controls the expression of TIGAR in HeLa cells. In lung cancer cells, where the over activation of Nrf2 is related to chemo resistance and radiotherapy, the relationship between Nrf2 and TIGAR seems to be indirect. With the results presented in this doctoral thesis we have contributed to a better understanding of the role of TIGAR in tumour metabolism and have laid the foundations for future studies aimed at blocking this protein in tumours.
PFKFB3: un gen clau en la reprogramació de les cèl·lules canceroses
(2017-09-27) Rodríguez García, Ana; Bartrons Bach, Ramon; Navarro i Sabaté, Àurea
[cat] L’objectiu d’aquesta tesi doctoral és profunditzar en els mecanismes que fan de PFKFB3 un gen clau en la reprogramació metabòlica. En concret, s’estudia els mecanismes de connexió de la insulina i el TGF-β1 amb el metabolisme de la glucosa i PFKFB3 en les línies cel·lulars de carcinoma de colon (HT29) i glioblastoma multiforme (T98G), respectivament. PFKFB3 és un enzim bifuncional homodimèric que pertany a la família de la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6- bisfosfatasa (PFK-2/FBPasa-2), que controla la conversió entre la fructosa-6-fosfat (Fru-6-P) a fructosa-2,6-bisfosfat (Fru-2,6-P2). Aquest metabòlit és important per a la regulació del flux glicolític ja que és un potent activador al·lostèric de l’enzim limitant de la glicòlisi fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). S’ha demostrat que PFKFB3 regula la glicòlisi durant la progressió del cicle cel·lular i el creixement. La seva activitat està regulada per HIF-1α, Akt, p38 i PTEN i es necessari per a la supervivència i creixement de molts tipus de càncer. S’ha descrit que la insulina té un paper important en el creixement cel·lular i la supervivència del càncer. Als anys 70 es va descriure que concentracions fisiològiques d’insulina estimulen la proliferació de les cèl·lules de càncer de mama. També s’ha demostrat que l’expressió de TGF-β en gliomes malignes proporciona avantatges de supervivència de les cèl·lules tumorals potenciant el creixement cel·lular, la migració, la invasió, la angiogènesi, la immunosupressió i les propietats de les cèl·lules mare. A més, la presencia d’insulina i la sobrexpressió de TGF-β s’ha relacionat amb la inducció de l’efecte Warburg. En canvi, no es coneix amb detall els mecanismes moleculars que relacionen tant la insulina com el TGF-β amb una glicòlisi millorada en els sistemes tumorals i, especialment, amb la PFKFB3. Tenint en conte això, la tesi es va organitzar en dos capítols de resultats. En el primer capítol, s’estudia la regulació de PFKFB3 en resposta a insulina en les cèl·lules HT29. Els resultats obtinguts demostren que la insulina provoca un augment significatiu de la concentració de Fru-2,6-P2 i de lacat intracel·lular ja als 30 minuts de tractament, que correlacionen amb l’activació de PFKFB3 i de PFKFB2 per fosforilació a través de la via de PI3K/Akt. En canvi, a temps més llargs, la insulina indueix l’expressió gènica de PFKFB3 i també participa la via de PI3K/Akt. La seqüència localitzada entre els nucleòtids -1269 i -1297 del promotor humà de PFKFB3 és la responsable d’aquesta inducció possiblement a través del factor SREB-1c. Al segon capítol, es presenta la regulació de diversos gens glicolítics, entre ells PFKFB3, en resposta a TGF-β1 en les cèl·lules de glioblastoma T98G. Els resultats obtinguts demostren que PFKFB3 és regulat a nivell transcripcional en resposta a aquest factor a través de l’activació conjunta de la via de Smad, p38 MAPK i PI3K/Akt. També es demostra que PFKFB3 és indispensable per al augment de la capacitat de les cèl·lules de formar colònies en resposta a TGF-β1. En resum, els resultats presentats confirmen que PFKFB3 té un paper important en el metabolisme glicolític en les cèl·lules tumorals. Per tant, conèixer en profunditat els factors que dirigeixen l’expressió de PFKFB3 com els mecanismes moleculars que participen en la seva complexa regulació mitjançant diferents vies de transducció de senyals permet pensar en nous mètodes terapèutics basats en la seva inhibició, i així en la inhibició de l’elevada taxa glicolítica que suposa tenir-la activada.
Model animal de malalties associades a canals de clorur en peix zebra
(2017-09-26) Pérez Rius, Carla; Estévez Povedano, Raúl; Barrallo Gimeno, Alejandro
[cat] El clorur compleix un conjunt de funcions essencials perquè la cèl·lula pugui realitzar correctament diferents processos fisiològics, com la regulació de l’excitabilitat en les cèl·lules musculars, participa en el transport transepitelial d’aigua i sals, en la regulació del pH en l’interior dels lisosomes i en la regulació del volum cel·lular, entre d’altres. La família de proteïnes ClC es divideix en dos grups: en canals iònics presents en la membrana plasmàtica i en transportadors Cl-/H+ presents en compartiments intracel·lulars. Fins ara s’ha descrit que ClC-2, els dos canals ClC-K i ClC-7 presenten les subunitats accessòries anomenades GlialCAM, Barttin i Ostm1, respectivament. En aquesta tesi s’han estudiat els canals iònics de membrana plasmàtica ClC-1, ClC-2 i els canals ClC-K. Mutacions en els gens que codifiquen aquestes proteïnes donen lloc a malalties rares en humans i altres espècies animals, com la Miotonia congènita (degut a la pèrdua d’activitat ClC-1, es caracteritza per un retard en la repolarització muscular), un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant (degut a la pèrdua de ClC-2) i síndrome de Bartter tipus III (degut a la pèrdua de ClC-Kb). En aquesta tesi hem identificat i iniciat la caracterització dels gens ClC ortòlegs en el peix zebra. Hem estudiat el patró d’expressió tant en adults com en embrions. En adults, hem descrit que els canals clcn1a i clcn1b són específics de múscul esquelètic, el canal clcn2a és el més abundant en teixits excitables com el cervell, ull i cor; el canal clcn2b és ubic, el canals clcn2c s’expressa en teixits on es dóna intercanvi iònic amb el medi extern com les brànquies i el ronyó i el canals clcnk s’expressa en el ronyó. En embrions, només hem pogut estudiar la localització de clcn2b, el qual s’expressa en el túbul contornejat proximal del pronefros, i de clcn2c, el qual s’expressa en la regió dels arcs branquials. Hem detectat expressió dels gens clcn1a i clcn1b a partir de 1dpf i 2dpf, respectivament. Part important de la tesi ha estat la generació i validació d’anticossos policlonals tant pels canals clc-1a, clc-1b, clc-2a, clc-2b, clc-k com per les subunitats glialcama i barttin. També hem demostrat in vitro que es conserva la interacció dels canals clc-2 amb GlialCAM, modificant el seu tràfic a les unions cel·lulars i les corrents. De la mateixa manera, el paper estabilitzador de Barttin sobre els canals ClC-K també es troba conservat en el peix zebra. Estudis d’immunofluorescència en larves de peix zebra a 3dpf mostren una localització cel·lular diferent en el múscul esquelètic, mentre que clc-1a es localitza al sarcolema, clc-1b es troba envoltant els túbuls T. A més, hem desenvolupat eines de transgènesi amb promotors específics de teixit per tal de realitzar experiments d’expressió en múscul esquelètic (503unc) de proteïnes de fusió fluorescents (tant humanes com de peix zebra). Una part important d’aquest treball ha estat la generació de models de pèrdua de funció en peix zebra mitjançant la tecnologia CRISPR/Cas9. Hem aconseguit generar animals knock out dels gens clcn1a i clcn1b (el doble knock out encara està en procés), els quals han estat validats com a tal gràcies als anticossos generats durant aquesta tesi. Finalment, hem realitzat uns estudis locomotors preliminars i aquests mostren com les línies mutants per clcn1a i per clcn1b no presenten cap alteració en el moviment espontani ni en la resposta a estímuls de vibració. És probable que la manca d’un dels dos canals clc-1 sigui compensada pel seu paràleg, per aquesta raó estem generant una línia nul·la pel canal clc-1. En aquesta línia deficient per clc-1 esperem detectar alteracions motores reminiscents a les observades en pacients de Miotonia congènita.
Unveiling novel components of the protein complex responsible for cGMP synthesis in retinal photoreceptors: role in cell physiology and disease
(Universitat de Barcelona, 2016-11-18) López Begines, Santiago; Méndez Zunzunegui, Ana; Universitat de Barcelona. Departament de Patologia i Terapèutica Experimental
[eng] In photoreceptor cells of the retina, light triggers a protein G-mediated enzymatic cascade that leads to hydrolysis of cGMP. The drop in cGMP levels causes the closure of cGMP-channel at the plasma membrane, decreasing the influx of cations, mainly Na+ and Ca2+, hyperpolarizing the cell. This hyperpolarization decreases the rate of neurotransmitter release at the synaptic terminal. Photoreceptor cells must recover the darkness equilibrium and adapt their light sensitivity to the wide range of light intensities present in the natural world. Genetic defects at both activation and termination cascades leads to inherited retinal dystrophies. The cGMP levels are restored to darkness equilibrium by new synthesis by the complex formed by a membrane form of guanylate cyclase (RetGC) which is bound to a couple of proteins that confers it calcium sensitivity, Guanylate Cyclase Activating Proteins (GCAP1 and GCAP2). RetGC activity is stimulated by the drop of Ca2+ concentration because of close of cGMP-channels. There is a feedback loop between cGMP and Ca2+ that has a fundamental role in the processes of termination of light response and light adaptation. RetGC1 is responsible for cGMP synthesis in rods and cones. Mutations of genes involved in the cGMP synthesis complex have been linked to autosomal dominant inherited retinal dystrophies, both retinitis pigmentosa (adRP) as Leber’s congenital amaurosis (LCA) The regulation of RetGC by GCAPs proteins has been extensively studied in vitro, at biochemical and structural levels. However, many relevant aspects of regulation and trafficking of this complex in vivo remains unknown. By subretinal electroporation, we have analyzed the molecular determinants of subcellular distribution of GCAPs. We have determined that the complex between RetGC1 and GCAP1 is assembled in the inner segment and then transported to the outer segment, playing a determinant role the myristoylation of GCAP1 and the binding of GCAP1 to the cyclase. On the other hand, phosphorylation plays an essential role in subcellular distribution of GCAP2, and failures in subcellular localization of GCAP2 could contribute to explain the pathophysiology of the human G157R mutation linked to adRP. We here report a proteomic approach to identify novel interactors of Guanylate Cyclase Activating Protein 1 (GCAP1) that led to the unexpected discovery of inosine monophosphate dehydrogenase 1 (IMPDH1) interaction with retinal guanylate cyclase 1 (RetGC1). IMPDH1 is the rate-limiting step in de novo GTP synthesis, and mutations in impdh1 gene have been associated to adRP and LCA. We reveal an unanticipated direct interaction between IMPDH1 and RetGC1 at photoreceptor outer segments where phototransduction takes place. The interaction involves the dimerization and catalytic domains of RetGC1, and is significantly affected by IMPDH1 mutations associated to blindness. This finding links de novo GTP synthesis to GTP conversion to cGMP, bridging blindness-causative genes so far considered unrelated and creating a new scenario for the development of therapeutic strategies. By bridging distinct blindness-causative genes in a common biochemical pathway, we here contribute to reduce the apparent complexity of inherited retinal dystrophies grouping them on base common metabolic pathways. The main aim of this strategy of grouping genes on base of their function is to identify “hubs” of cell damage. We also have characterized the interaction between RetGC1 and Creatine kinase B, which could be supplying locally the ATP needed to maintain the catalytic activity in cones. This work aid to understanding about regulation and trafficking of RetGC/GCAPs complex, as well as the interplaying between the cGMP synthesis complex and de novo GTP synthesis, opening a new conceptual framework for pharmacological treatment of diseases that trigger changes in intracellular levels of cGMP, which in a prolonged way affect to cell survival, leading to inherited blindness.

Examinar

Enviaments recents