Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/35985

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 76

Vitreorretinopatía proliferativa y retinopatía diabética proliferativa: caracterización celular y glucoproteínas de adhesión de la matriz extracelular
(Universitat de Barcelona, 1992-12-03) Casaroli Marano, Ricardo Pedro; Vilaró, Senén, 1956-2005; Barraquer, Joaquin, 1927-; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] El presente trabajo está estructurado en dos bloques bajo un tema común: la enfermedad proliferativa intraocular. En el primer bloque se presenta, a modo de revisión bibliográfica general, la vitreorretinopatía proliferativa y la retinopatía diabética proliferativa. En el segundo bloque se presenta nuestra aportación experimental al estudio de las membranas fibrocelulares y fibrogliovasculares de ambas patologías, así estructurado: (1) la morfología y la ultraestructura de los componentes celulares, capilares y de la matriz extracelular, así como un estudio estereológico de la estimación matriz-volumen celular de estos tejidos; (2) la expresión de las proteinas de los filamentos intermedios de los diferentes tipos celulares involucrados en la formación de estas membranas; (3) la expresión de la fibronectina, la laminina, la vitronectina, y sus receptores (Alfa V-Beta 3 y Beta 1) en los capilares de neoformación y láminas basales que constituyen las membranas fibrogliovasculares de retinopatía diabética proliferativa. Asímismo, se evalúan las concentraciones de proteínas totales, fibronectina y vitronectina en muestras vítreas normales y patológicas; (4) el análisis de los cambios de expresión de estas glucoproteinas y sus receptores en las membranas epirretinianas de la vitreorretinopatía proliferativa, y las alteraciones de concentración intravitrea de fibronectina y vitronectina en los diferentes estadios clínicos de evolución de esta patología. La metodologia experimental está constituida básicamente por técnicas convencionales de microscopia óptica y electrónica, técnicas inmunocitoquímicas para microscopio óptico y electrónico de transmisión, electroforesis de proteínas, técnicas de inmunotransferencia, y cuantificaciones densitométricas mediante análisis de imágenes.
Estimación de sesgos de publicación en las revistas Atención Primaria y Medicina Clínica
(Universitat de Barcelona, 1997) Campillo, Carlos; Sanz, Ferran; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] OBJETIVOS: A continuación, se definen los objetivos de esta memoria de investigación. • Objetivo 1. Analizar los artículos originales recibidos para publicación por las revistas Atención Primaria y Medicina Clínica de Barcelona en función de las siguientes variables: estado de publicación, región española de procedencia del estudio, tamaño muestral, objeto del estudio, tipo de estudio o diseño empleado, nivel de complejidad del diseño y el análisis estadístico utilizados, grado de significación estadística de los resultados obtenidos, y calidad científica global del artículo. • Objetivo 2. Estimar la calidad científica de tos artículos recibidos por ambas revistas, empleando una escala construida y validad previamente con este propósito. • Objetivo 3. Delimitar el perfil editorial de los artículos originales que publican y rechazan ambas revistas en relación con las variables enumeradas en el objetivo l. • Objetivo 4. Averiguar si alguna de las variables mencionadas en el objetivo 1 está asociada con la publicación y el rechazo de los artículos originales que reciben para publicación las dos revistas. • Objetivo 5. Investigar la existencia de sesgos de publicación en las dos revistas y, en caso afirmativo, estimar si son introducidos por autores o editores. • Objetivo 6. Evaluar la validez de los procesos de revisión editorial y selección de los artículos originales que las dos revistas reciben para publicación. HIPÓTESIS: En esta memoria de investigación se formulan. además, las siguientes hipótesis. Por consiguiente, se trata de un estudio de contrastación, no de generación de hipótesis. • Hipótesis l. Los perfiles editoriales de Atención Primaria y Medicina Clínica difieren en cuanto a la cobertura temática y a las distribuciones del tipo y el objeto de los estudios presentados en los artículos originales que reciben para publicación. • Hipótesis 2. En las dos revistas, la calidad científica de los artículos publicados es más alta que la delos rechazados. • Hipótesis 3. Sólo la calidad de los estudios se asocia con el estado de publicación de los artículos originales que reciben ambas revistas. • Hipótesis 4. Atención Primaria y Medicina Clínica no introducen sesgo de publicación en los artículos originales que reciben. Si este sesgo existe, es responsabilidad exclusiva de los autores. • Hipótesis 5. La publicación de artículos originales en Atención Primaria y Medicina Clínica no está influida por el sesgo de región de procedencia.
Implicació de la calmodulina en la progressió a través de la fase G1 del cicle cel·lular
(Universitat de Barcelona, 1999-06-24) Taulés i Marín, Marta; Agell i Jané, Neus; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] Se ha estudiado el papel de la calmodulina (CaM) sobre la regulación de la actividad de la cdk4, cdk2, expresión y localización intracelular de las proteínas que intervienen en la progresión a través de la etapa H1 del ciclo celular. La adición de drogas anti-CaM a un cultivo de células NRK ("normal rat kidney") durante el principio del G1 provoca la inhibición de la actividad cdk4 y cdk2 y también se encuentra la proteína del retinoblastoma hipofosforilada. Los niveles totales de cdk4, ciclina D1, ciclina D2, cicE, p21 y p27 no están afectados por el tratamiento, pero sí que se observó una disminución en la cantidad de cicA y cdc2. La disminución en la actividad de la cdk4 no se debe a un cambio en las proteínas que se le asocian, ni a un cambio en la cantidad de proteínas inhibidoras unidas al complejo ckd4/cicD1. La inhibición de la CaM provoca una translocación del núcleo al citoplasma para la cdk4/cicD1, evitando de este modo que pRb se fosforile bajo el efecto de la droga anti-CaM. Mediante técnicas de inmunoprecipitación, columnas de afinidad y "pull down" se ha demostrado que la cdk4 y la cicD1 se asocian tanto in vivo como in vitro a través de una proteína aceptora de CaM. Como la Hsp90 interactúa con la cdk4 in vivo, y que dicha interacción puede facilitar la translocación de la cdk4 y la cicD1 al núcleo, la Hsp90 es una buena candidata para desempeñar el papel de CaMBP en la transcolocación de la cdk4/ckcD1 al núcleo. Por otro lado se encontró que la p21 coinmunoprecipitaba con la CaM y también en sentido contrario, esta interacción se comprobó que era directa utilizando "pull down". Además se comprobó que la CaM era esencial para acumulación de la p21 en el núcleo.
Contribució de la P-selectina en els processos inflamatoris
(Universitat de Barcelona, 2003-04-30) Massaguer i Vall-llovera, Anna; Pizcueta Lalanza, María Pilar; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] La P-selectina és una molècula d'adhesió que mitjança la interacció de les cèl·lules endotelials i plaquetes activades amb els leucòcits. Desenvolupa un paper determinant en la resposta inflamatòria, ja que possibilita l'adhesió inicial dels leucòcits circulants a l'endoteli activat, generant un rodament deis leucòcits sobre la paret vascular que és clau per la posterior migració i acumulació deis leucòcits als lIocs de lesió, on desenvolupen la seva resposta immunològica. La P-selectina també participa en la trombogènesi, promovent la interacció entre els leucòcits i les plaquetes, de manera que afavoreix la incorporació dels leucòcits als trombes en formació i la seva activació. La P-selectina juga un paper important en diversos models inflamatoris experimentals i s'ha vist que la seva inhibició, bé mitjançant anticossos que bloquegen la seva funció o generant animals genèticament deficients en la proteïna, millora l'evolució de la inflamació. Per tant, el bloqueig de la P-selectina en humans podria tenir un elevat potencial terapèutic. Però abans és important definir amb precisió la seva funció específica en el desenvolupament de respostes inflamatòries concretes, de cara a avaluar l’eficàcia del seu bloqueig com a tractament en desordres inflamatoris. És per això que l'objectiu general de la present tesi és caracteritzar la contribució de la P-selectina als processos inflamatoris.
CD50 (ICAM-3): Una nova molècula d'adhesió leucocitària. Clonació gènica i anàlisi funcional.
(Universitat de Barcelona, 1994-07-27) Juan i Otero, Manuel; Vives i Puiggròs, Jordi, 1941-; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] L'objectiu general, consistent a definir I'estructura i funció del CD50, es va concretar amb els quatre objectius específics següents: 1.- Anillisi de la seqüencia genetica i proteica del C050. 1 .a..- Definició de la seqüècia aminoacídica de la glicoproteïna, a travès de la seqüenciació nucleotídica de! cDNA del CD50.. 1.b.- Oeterminació d'homologies en aquestes seqüències per a perpetre suggerir una possible implicació funcional del C050. 2.- Anafisi de fa participació del C050 en les funcions adhesives cel.lulars. 2.a.- Estudi de la participació cel.lular del CD50 en els mecanismes de contacte limfocit-endoteli. 2.b.- Anàlisi del paper de I'estimulació del CD50 en els mecanismes de contacte interlimfocitari. 3. - Estudi de possibles vies de transducció de senyals intracel.lulars que medien la co-estimulació cel.lular a través del CD50. 3.a.- Analisi en una línia cel.lular T limfoblastoide, la linia Jurkat, dels mecanismes de transducció de senyals. 3.b.- Determinació de la relació de la co-estimulació cel.lular del CD5O amb la inducció d'efectes cel.lu!ars que evidenciïn activació. 4.- Analisi del gen del CD50 humà, per tal de determinar I'existència de possibles polimorfismes.
Regulación de K-Ras por Ca2+/CaM
(Universitat de Barcelona, 2006-07-21) López Alcalá, Cristina; Agell i Jané, Neus; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] Las proteínas de la superfamilia Ras son pequeñas proteínas G monoméricas de pesos moleculares de entre 20 y 40 kDa que actúan como interruptores moleculares regulando el inicio, duración y finalización de una gran variedad de funciones celulares (Takai, Yoshimi et al. 2001). Esta superfamilia comprende más de 150 proteínas (Fig. 1) con homólogos encontrados en Drosophila, C.Elegans, S. cerevisiae, Dictyostelium y en plantas. Las proteínas Ras más conocidas y estudiadas, H, N y K-Ras, son los miembros fundadores de esta gran familia, la cual se divide en 5 subfamilias en base a similitudes en la secuencia y funcionalidad de las proteínas que las componen: Ras, Rho, Rab, Ran y Arf (Fig. 2) (Wennerberg, Krister et al. 2005) Además de compartir una estructura parecida, todas estas proteínas tienen unas características generales comunes: tienen capacidad de unir nucleótidos de guanina (GTP o GDP), poseen actividad GTPasa intrínseca y necesitan estar unidas a sistemas de membrana para realizar su función. Las GTPasas de la superfamilia Ras funcionan como interruptores moleculares regulados por la unión al nucleótido GTP o GDP. Existen unas secuencias consensus, llamadas "G box", comunes a todas las proteínas de la superfamilia Ras, en el extremo N-terminal (Takai, Yoshimi et al. 2001). Estas secuencias son las responsables para la interacción con GDP o GTP y para la actividad GTPasa. Estas pequeñas GTPasas tienen una elevada afinidad por el GDP y el GTP y presentan baja actividad GTPasa intrínseca. El ciclo GDP/GTP está controlado por dos tipos de proteínas reguladoras: Las proteínas intercambiadoras de nucleótidos "GEFs" (Guanine-nucleotide-exchange factors) promueven la formación de la forma activa de la GTPasa unida a GTP (Schmidt, Anja and Hall, Alan 2002) (Mitin, N. et al. 2005) y las proteínas "GAPs" (GTPase-activating proteins) aceleran la hidrólisis del GTP y por tanto aceleran la formación de la forma inactiva de la GTPasa unida a GDP(Bernards, Andre and Settleman, Jeffrey 2005). Las GTPasas de una misma rama de la superfamilia pueden compartir o no diferentes GEFs y GAPs. Las GTPasas de ramas diferentes presentan diferentes GAPs y GEFs en cuanto estructura pero que, mecanísticamente son similares. El que la GTPasa esté unida a GTP o GDP comporta dos conformaciones similares pero muy distintas en dos regiones muy concretas de la proteína: la Switch I y la Switch II. El cambio conformacional de la proteína unida a GTP posee una elevada afinidad por los efectores. Estos cambios en el Switch I y II son los que permiten a las proteínas reguladoras, GAPs y GEFs y, a las efectoras, sensar el nucleótido al que la GTPasa se encuentra unido. Las proteínas Arf y las proteínas Ran tienen secuencias en el extremo amino y carboxi terminal respectivamente, que también sufren unos cambios conformacionales significativos al estar unidas a GTP o GDP. En general las GTPasas son activas cuando se encuentran unidas a GTP, pero, para las proteínas Rab, Arf y Ran el estar unidas a GDP comporta también unas determinadas funciones específicas. La presente tesis se concentra en dos objetivos: el primero, determinar el dominio de unión de K-Ras a Calmodulina, y el segundo, investigar cómo afecta esta interacción a la funcionalidad de K-Ras
Identificació d'un nou mecanisme de regulació de l'estabilitat de p27(kip1)
(Universitat de Barcelona, 2005-10-21) Aguasca i Marsà, Marta; Bachs Valldeneu, Oriol; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] Els objectius d'aquesta tesi van ser plantejats per tal d'aprofundir en l'estudi de la implicació de la proteïna p27(kip1) en processos de tumorogènesi i metàstasi, donat que els nivells baixos de p27(kip1) son cosiderats un factor de mal pronòstic en els càncers humans. Així doncs, els objectius proposats pel desenvolupament d'aquest treball són els següents: · Identificació de noves proteïnes d'unió a p27(kip1) · Caracterització funcional de les noves interaccions amb p27(kip1) · Implicació d'aquestes noves funcions de p27(kip1) amb el cicle cel·lular i càncer.
Inducció experimental de tumors de vies urinàries en rates Sprague-Dawley amb 2,2-dioxo-di-n-propilnitrosamina (DOPN). Estudi comparatiu amb l'home
(Universitat de Barcelona, 1989-05-22) Solé Arqués, Manuel; Cardesa García, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] S'han estudiat les característiques de la inducció de tumors de vies urinàries en rates Sprague-Dawley amb 2,2-dioxo-di-n-propilnitrosamina, un metabòlit intermediari en el procés d'activació de la di-n-propilnitrosamina per beta-oxidació, tot relacionant la incidència de lesions amb la dosi i la durada de l'exposició al carcinògen, el sexe de l'animal, i la localització. Per tal d'establir la utilitat del model experimental, s'ha comparat la morfologia dels tumors i les lesions preneoplàsiques induïdes amb una àmplia sèrie de tumors i lesions associades de vies urinàries en l'home. Igualment, s'ha comparat, per mitjà de tècniques immunohistoquímiques, l'expressió de marcadors estructurals i funcionals en els tumors i les lesions preneoplàsiques del model d'experimentació i en els de la sèrie humana revisada. La 2,2-dioxo-di-n-propilnitrosamina (DOPN) s'ha administrat per via subcutània a tres grups experimentals, cada un d'ells composta per 30 rates Sprague-Dawley (15 mascles i 15 femelles), a dosis setmanals corresponents a 1/5, 1/10 i 1/20 de la dosi letal mitjana (LD(50)=123 mg/Kg per als mascles, 107 mg/Kg per a les femelles). Un quart grup ha estat mantingut com a control, tractat amb CINa. S'han revisat tots els casos de neoplàsies de vies urinàries registrats a l'arxiu de Patologia Quirúrgica del Departament d'Anatomia Patològica de l'Hospital Clínic de la Facultat de Medicina de la Universitat de Barcelona, compresos en el periode 1976-1985. La sèrie de tumors de pelvis renal s'ha ampliat fins al 1968, amb un total de 20 tumors d'aquesta localització. S'han valorat separadamente els casos que presentaven diverses biòpsies al llarg del temps de l'estudi, estudiant les característiques de les lesions en relació amb l'evolució posterior. L'estudi immunohistoquímic s'ha realitzat amb la tècnica del complex avidina-biotina-peroxidasa (ABC), fent servir anticossos anti-TPA-B(1), EMA, CEA, i la lectina de l'Ulex Europaeus (UEA-I). L'adminlstració de DOPN a les rates Sprague-Dawley ha induït una elevada proporció de tumors de vies urinàries. La incidència de tumors ha estat superior amb les dosis més altes, en femelles més que en mascles, i en pelvis renal més que en bufeta urinària. En el gru~ experimental tractat amb les dosis més altes (1/5 LD(50)) s'han induït tumors de pelvis renal en el 100% de les femelles i en el 73% dels mascles. Dels 66 tumors induits en total en els tres grups, 65 han estat neoplàsies de cèl.lules transicionals, i l'altre un carcinoma escamós. Han predominat els papil.lomes i carcinomes de baix grau. El 27% dels tumors induïts han estat invasors. La diferenciació escamosa ha estat freqüent en tumors de tots els graus. La freqüència ha estat superior en els carcinomes invasors que en els tumors no invasors. Només s'ha identificat un carcinoma escamós pur sense presència de component transicional, La hiperplàsia ha estat l'alteració més freqüent de l'uroteli no tumoral. S'ha observat en el 94% dels animals amb tumor i en el 51% dels animals sense tumor dels grups experimentals, tant en pelvis renal com en bufeta urinària. Lesions displàsiques i carcinornes "in situ" s'han identificat només en sis animals, i en tots els casos s'associaven a carcinomas invasors de grau II i III. No s'ha observat reacció positiva valorable dels tumors ni de les lesions preneoplàsiques experimentals amb anticossos contra TP, EMA i CEA. la lectina de l 'Ulex Europaeus (UEA-I) ha marcat positivamente la majoria dels tumors experimentals, independentment del seu grau i de la presència o no d'invasió, però no ha marcat l'uroteli normal ni tampoc les cèl.lules endotelials ni els eritròcits. En la sèrie de 627 tumors humans de vies urinàries revisats, el 95,7% dels tumors eren localitzats a la bufeta urinària, el 2,2% a l'urèter i el 2,1% a la pelvis renal. Més del 50% dels tumors de pelvis renal han aparegut aïlladament, sense associar-se ni sincrònicament ni metacrònicament a tumors d'altres segments de la via urinària. El 98,7% dels tumors humans revisats han estat neoplàsies de cèl.lules transicionals, i el 1,3% restant carcinomas escamosos. Entre els tumors transicionals, el 7,4% eren papil.lomes, el 74% carcinomes papil.lars, i el 17,8% carcinomes no papil.lars. La diferenciació adenocarcinomatosa ha estat més freqüent que la diferenciació escamosa en els carcinomes transicionaIs humans. Totes dues s'associen sempre amb carcinomes invasors, preferentment d'alt grau, la hiperplàsia de I 'uroteli no tumoral s 'ha trobat associada a la majoria de tumors transicionaIs de baix grau. La majoria dels carcinomes de grau II han presentat displàsia urotelial associada. El carcinoma "in situ" és la lesió que s'ha associat amb més freqüència als carcinomes de grau III. Tant l'antígen polipeptídic tissular (TPA) com l'antígen de membrana epitelial (EMA) són positius en la majoria de tumors i lesions preneoplàsiques humanes, sense que permetin detectar diferents patrons de positivitat en relació amb les característiques del tumor ni amb l'evolució posterior de cada cas. La presència de CEA ha estat inconstant tant en els tumors com en l'uroteli no tumoral, per bé que s'ha detectat amb freqüència en els tumors d'alt grau. La presència de l'antígen H del sistema ABH dels grups sanguinis, detectat amb l'UEA-I, ha estat més marcada en els carcinomes papil.lars de grau l que amb els de grau II i III. Tots els carcinomes invasors no papil.lars han resultat positius. L'expressió d'aquest antígen tendeix a reduïr-se en l'uroteli normal associat a carcinomes invasors, però no en els casos de tumors no invasors que van desenvolupar posteriorment carcinoma invasor. En les hiperplàsies, la reacció ha estat sempre positiva, i ha estat generalment negativa en les lesions displàsiques. En conclusió, l'administració de DOPN a rates Sprague-Dawley constitueix un model experimental útil per a l'estudi de la carcinogènesi de les vies urinàries, i especialment de la pelvis renal, atès que és capaç d'induir tumors de pelvis renal en una elevada proporción d'animals; igual que succeeix en l'home, la majoria dels tumors de pelvis renal no s'associen amb altres tumors de vies urinàries, igual que en la sèrie humana, més del 98% dels tumors son derivats de l'epiteli transicional; es poden intuir tumors de tots els graus histològics, per bé que la proporció de tumors de baix grau és més alta que en l'home. Tant en aquest model experilnental com en la sèrie humana, la presència d'invasió es correlaciona amb el grau histològic del tumor. En els tumors experimentals, la lectina UEA-I detecta probablement estructures hidrocarbonades diferents dels antígens relacionats amb els grups sanguinis. De la mateixa manera, l'expressió d'estructures no relacionades amb els grups sanguinis explicaria la positivitat dels carcinomes no papil.lars humans per a aquest marcador. Tant en el model experimental com en la sèrie humana, les alteracions proliferatives de l'uroteIi no tumoral reflecteixen, en general, el grau histològic del tumor al qual s'associen. Probablement, aquestes lesions no tenen més valor pronòstic que el mateix grau del tumor, excepte en una petita proporció de carcinomes de baix grau amb alteracions displàsiques associades, i en els casos en que es detecten lesions displàsiques o carcinoma "in situ" aïllats.
Influència de les mutacions K-RAS en el fenotip angiogènic. K-RAS i neovasculació en carcinomes de còlon i recte: Efectes sobre la progressió tumoral i angiogènica de fibroblastes NIH3T3 transfectats amb mutacions K-RAS inoculades a diferents condicions.
(Universitat de Barcelona, 2006-05-29) Figueras i Amat, Agnès; Capellá, G. (Gabriel); Arbós i Via, Maria Antònia; Viñals Canals, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] Una simple mutació en el gen K-Ras comporta transformació cel·lular. Les cèl·lules tenen pocs punts de transició que puguin determinar d'aquesta manera tan important el comportament cel·lular. Fins al punt que hi ha diferències entre diferents mutacions puntuals del mateix gen. Així va quedar demostrat que el creixement dels tumors subcutanis de NIH3T3 amb mutació en el codó 13 ( G:T - A:T/ Gly-Asp ASP13) tenen un període de latència més llarg però creixen més ràpid que els tumors NIH3T3 amb K-Ras mutat en el codó 12 (G:T - A:T/ Gly-Cys CYS12). En front a aquests resultats postulem que les mateixes mutacions puntuals en el gen K-Ras que determinen diferents fenotips de cèl·lules tumorals poden determinar diferències angiogèniques en els tumors que desenvolupen. Els marcatges específics amb anticossos de PECAM, desmina, α-Actina de la musculatura llisa i macròfags assenyalen que els tumors amb CYS12 tenen major densitat de vasos sanguinis però hem trobat diàmetres més grossos i més cèl·lules desmina positives al voltant dels vasos sanguinis dels tumors ASP13. La proliferació endotelial no ens aporta diferències entre els diferents tipus de tumors en un moment de creixement tumoral ja consolidat. Han estat analitzats els nivells de VEGF i els tumors amb mutació ASP13 expressen més aquest factor de creixement endotelial que no els tumors amb mutació CYS12. El fet de que in vitro també es denotin aquestes diferències ens remarca que la diferència mutacional en Ras és determinant. La presència d'altres cèl·lules de suport que hem descrit en els tumors ASP13 podria remarcar aquesta diferència però no de manera exclusiva. El VEGF que estan produint aquestes cèl·lules actua sobre les cèl·lules endotelials. Podem descartar l'efecte autocrí ja que no hem observat expressió ni estimulació del VEGFR2 in vitro. L'angiogènesi depent de la balança entre els factors pro i anti angiogènics. TSP-1, Ang 4 (precursor) i Ang-1 han estat analitzats en aquest sistema per Western Blot. L'expressió de TSP-1 en el sistema in vivo ha estat indetectable. En el cas de les angiopoietines observem una tendència dels tumors CYS12 acumular-ne més que els ASP13, però els resultats del Western Blot han estat molt heterogenis. L'absència de TSP-1 dóna força a les accions del VEGF en els tumors ASP13. Sembla que les angiopoietines podrien tenir un paper en el sitema angiogènic dels tumors CYS12. L'expressió de les MMPs ha estat analitzada per zimografia i Western Blot. In vitro no s'ha detectat expressió de MMP9 ni MMP7, d'aquesta manera queda palès que l'expressió d'aquestes metaloproteïnases la realitzen majoritàriament les cèl·lules acompanyants al tumor. Ja està descrit que els macròfags són grans productors de MMP9 i MMP7 i també que la seva expressió pot estar estimulada per citoquines, factors de creixement com el VEGF i molt induïda per l'hipòxia dels macròfags. Es relaciona aquestes dues MMPs amb proliferació i invasió cel·lular, promoció de l'apoptosi i alliberació de factors angiogènics entre altres possibles accions. Per tan afecten el fenotip vascular que hem descrit en els tumors ASP13. Els tumors amb mutació CYS12 incrementen la MMP2 activa respecte dels tumors ASP13 mentre que aquests segons tenen major expressió de TIMP-2 i MMP14 que els primers. La funció de promoure la migració endotelial que se li atribueix a la MMP2 podria explicar-nos la dispersió de les cèl·lules endotelials i el major número de vasos que observem en els tumors CYS12. TIMP-2 i MMP14 amb la capacitat de moderar la proliferació endotelial i d'estimular la tumoral respectivament poden contribuir a definir el fenotip angiogènic i tumoral dels tumors ASP13. Hem començat a traslladar aquests resultats en una sèrie de tumors colorectals humans on coneixem les mutacions en el gen K-Ras i disposem d'un seguiment clínic de més de 4 anys. No hem trobat diferències en la densitat vascular però si una tendència a expressar VEGFR2 en els tumors amb mutació en el gen K-Ras que comporta menys supervivència global. Aquests resultats confirmen que hi ha diferències angiogèniques entre diferents mutacions del gen K-Ras. Sembla que el VEGF, les metaloproteïnases i les cèl·lules de suport tumorals convergeixen a promoure aquestes diferències. En els tumors humans caldrà tenir més paràmetres per determinar si existeixen diferències.
DEFENSINAS: Moléculas de la inmunidad innata con actividad frente al VIH y su progresión a SIDA
(Universitat de Barcelona, 2009-05-28) Rodríguez García, Marta; García Alcaide, Felipe; Climent Vidal, Núria; Enrich Bastús, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] Las defensinas son moléculas efectoras de la inmunidad innata con un amplio espectro antimicrobiano e importantes efectos inmunomoduladores. Dentro de su amplio espectro se incluye la inactivación del VIH, actuando directamente sobre el virus y también sobre las células diana. Nosotros hipotetizamos que las células dendríticas (DC) producirían alfa defensinas 1-3, lo que les permitirá inactivar al virus antes o después de su captura y hacer una presentación más eficiente a la célula CD4 sin producir su infección. Esta hipótesis predice que existirá una variabilidad interindividual en la producción de estas defensinas, lo que podrá constituir un factor de resistencia/susceptibilidad frente a la infección por VIH y su evolución a SIDA. En nuestros resultados encontramos que las DC inmaduras producen y secretan alfa-defensina 1-3 y que esta producción disminuye tras la maduración de las DC con distintos agentes madurativos. Además, las citocinas pro-inflamatorias y la infección viral aumentan la producción de defensinas, mientras que el tratamiento de las células con estrógeno la disminuye. Por otro lado, las alfa-defensinas 1-3 son capaces de modular la maduración y diferenciación de las DC e inducen la secreción de IL-8 de forma dosis-dependiente. Por último, el análisis de los pacientes infectados por VIH reveló que las DC de estos pacientes producen mayores niveles de alfa-defensinas 1-3 que los controles sanos. Además, dentro del grupo de infectados, aquellos que controlan espontáneamente la infección son los mayores productores. Se encontró asimismo una correlación positiva con los niveles de células T CD4 y una asociación entre mayores niveles de alfa-defensinas 1-3 secretadas por DC y una menor progresión de la enfermedad. En conclusión, una mayor producción de alfa-defensinas 1-3 por las DC de pacientes infectados por VIH será un factor protector frente a la evolución de la enfermedad.
Regulació del complex ciclina A-CDK2 per l'acetilasa PCAF
(Universitat de Barcelona, 2009-05-05) Mateo González, Francesca; Bachs Valldeneu, Oriol; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] Els complexes ciclina-CDK són elements clau perquè el cicle cel·lular es doni de manera ordenada. Estan regulats a diferents nivells ja que les seves funcions són essencials per a la correcta progressió del cicle. El primer nivell de regulació és la interacció entre la ciclina i la CDK. En segon lloc, aquestes proteïnes poden experimentar fosforilacions i defosforilacions activadores i inhibidores. En tercer lloc, aquests complexes poden ser inhibits per la interacció amb CKIs (CDK Inhibitors). Finalment, la localització subcel·lular també és una manera de regular l'activitat d'aquests complexes, ja que només són actius al nucli de la cèl·lula. En aquest treball presentem un nou mecanisme de regulació dels complexes ciclina-CDK. Concretament hem observat que els membres del complex ciclina A-CDK2 interaccionen amb l'acetilasa PCAF. Aquesta proteïna ha estat generalment considerada com a un co-activador transcripcional gràcies a la seva capacitat d'acetilar histones i activar la transcripció gènica. Tanmateix, també s'ha vist que és capaç d'acetilar proteïnes no-histones com ara p53 o MyoD, i com a conseqüència està implicada en altres funcions cel·lulars com la diferenciació o la resposta a dany al DNA. L'acetilasa PCAF s'uneix al complex ciclina A-CDK2 tot inhibint la seva activitat quinasa. A més, acetila la ciclina A, cosa que comporta la seva degradació pel sistema ubiquitina-proteasoma. PCAF també acetila CDK2 a la lisina 33, la qual es troba molt conservada a la família de les CDKs, ja que és un aminoàcid crucial per a la interacció amb l'ATP. L'acetilació de CDK2 a la lisina 33 comporta la inhibició de la seva activitat quinasa i la seva separació de la ciclina A. En conclusió, els resultats d'aquesta tesi aporten un nou nivell de regulació dels complexes ciclina-CDK desconegut fins ara, i que cal tenir en compte com a possible mecanisme d'acció dels fàrmacs basats en compostos inhibidors de deacetilases els quals, d'altra banda, estan donant bons resultats en el tractament de malalties hematològiques i tumors sòlids.
Mecanismes de senyalització intracel·lulars en isquèmia/reperfusió hepàtica
(Universitat de Barcelona, 2009-02-10) Llacuna Durán, Laura; Morales Muñoz, Albert; Fernández-Checa Torres, José Carlos; Enrich Bastús, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] El dany produït per isquèmia/reperfusió (I/R) pot ser un problema clínic per a diferents òrgans com el cervell, cor, ronyó o fetge, i és un fenomen on el dany cel·lular en un òrgan hipòxic és accentuant per la subsegüent arribada d'oxigen. El dany hepàtic per I/R pot donar-se durant transplantaments, xocs circulatoris i reseccions de fetge per a tumors, i a més, contribueix a disminuir la quantitat de fetges disponibles per a ser trasplantats a causa de l'elevada susceptibilitat dels fetges marginals a la isquèmia. En efecte doncs, minimitzar els efectes adversos del dany per I/R podrien significar un augment dels èxits en els trasplantaments hepàtics. La isquèmia ja causa certa mort cel·lular per se, però el principal dany hepàtic es manifesta durant el procés de reperfusió. El procés del dany produït per I/R combina molts factor interrelacionats que produeixen una cascada de respostes que culminen amb una fallida hepàtica. Hi ha una clara activació de cèl·lules de Kupffer, cèl·lules polimorfonuclears i cèl·lules endotelials. L'apoptosi, o mort cel·lular programada, és reconeguda com a clau en el dany produït per isquèmia/reperfusió, essent el factor de necrosi tumoral (TNF) un element crític en aquest procés. En aquest context, la ceramida ha emergit com un lípid intermediari que juga un rol important en la resposta a l'estrès i mort cel·lular induïda per TNF. Tot i que els nivells de ceramida poden incrementar per la via de síntesis de novo, la hidròlisi de la esfingomielina mitjançant l'activació d'esfingomielinases (SMases), tant l'àcida com la neutra, constitueix una via efectora ràpida i habitual per a la generació de ceramida després de la unió del TNF al seu receptor de membrana. En particular, resultats previs han demostrat que l'esfingomielinasa àcida està implicada en l'apoptosi hepatocel·lular i el dany hepàtic induït pel TNF. Els radicals lliures generats durant la reperfusió i la influència del TNF en el dany hepàtic per isquèmia/reperfusió apunten als esfingolípids com a possibles mediadors. A més, s'han observat increments en els nivells hepàtics de ceramida en processos d'isquèmia freda i reperfusió en calent, tot i que les seves conseqüències i regulació no han estat prèviament caracteritzades. Per altra banda, el factor de transcripció nuclear κB (NF-κB) es coneix com a regulador de vies d'inflamació i de supervivència, és a dir que participa tant en mecanismes protectors com en la generació de citocines inflamatòries, i el balanç d'aquests dos efectes controla finalment el grau de dany hepàtic durant la I/R. S'ha observat que les espècies reactives d'oxigen (ROS) poden interferir en l'activació d'NF-κB, i els ROS juntament amb el TNF s'han descrit com a participants claus en el desenvolupament del dany causat per la I/R hepàtica. De manera que els objectius d'aquest estudi van ser en primer lloc examinarel paper rol de l'esfingomielinasa àcida en l'homeòstasi de la ceramida i la seva contribució en el dany provocat per I/R hepàtica, i en segon lloc ens vàrem proposar analitzar el paper d'NF-κB en la isquèmia/reperfusió. Vàrem observar que durant la I/R hi ha acumulació transitòria de ceramida degut a l'activació seqüencial de l'esfingomielinasa àcida seguit de l'activació de la ceramidasa àcida. També vam demostrar que la generació de ceramida via esfingomielinasa àcida (ASMasa) activa JNK provocant la fosforilació i translocació de BimL a la mitocòndria, i que tant l'administració d'inhibidors farmacològics de l'esfingomielinasa àcida (imipramina), com la regulació a la baixa d'aquest enzim amb ARNs d'interferència disminueixen el dany hepàtic causat per I/R. En definitiva, s'observa que la generació de ceramida via ASMasa contribueix a la mort hepatocel·lular induïda per I/R mitjançant un mecanisme apoptòtic depenent de la mitocòndria, i estratègies encaminades a disminuir la generació de ceramida poden protegir front el dany hepàtic causat per I/R. Paral·lelament, vam observar que l'activació hepàtica d'NF-κB després de la I/R és sensible a l'estat redox cel·lular, i que hi ha una activació diferencial dels gens κB depenents segons el tipus cel·lular: en els hepatòcits, el mecanisme d'activació d'NF-κB és dependent de Src i provoca una subsegüent activació de gens protectors κB depenents, en canvi en les cèl·lules de Kupffer, hi ha una activació canònica d'NF-κB i es transactiven els gens proinflamatoris κB depenents. Vam observar que isquèmies llargues indueixen estrès oxidatiu a l'hepatòcit disminuint l'activació d'NF-κB i l'expressió de gens antiapotòtics com la MnSOD i cIAP, i en canvi, la inactivació de les cèl·lules de Kupffer durant la I/R, disminuïa la producció de gens proinflamatoris κB depenents com TNF i IL-1β. De manera que, vam demostrar que estratègies antioxidants específiques encaminades a disminuir la producció de radicals als hepatòcits pot contribuir no només a reduir l'impacte directe dels radicals en la generació de dany hepàtic, sinó també en el manteniment de l'activació dels gens protectors κB depenents durant la isquèmia/reperfusió.
Activació i regulació de la quinasa Srk1 en resposta a estrès en "Schizosaccharomyces pombe"
(Universitat de Barcelona, 2009-05-15) Lambea Martínez, Eva; Aligué i Alemany, Rosa Maria; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] Les cèl·lules de llevat, al igual que les cèl·lules eucariotes d'organismes superiors, responen a situacions d'estrès extracel·lular activant la via de les MAP quinases, les quals transdueixen el senyal activant l'expressió de gens necessaris per a mantenir l'homeostasi cel·lular. Evidències experimentals recents ens indiquen que la nova quinasa Srk1, identificada en el nostre grup en cèl·lules de llevat, participa tant en la resposta a estrès cel·lular com en la regulació del cicle cel·lular (López-Avilés S, Grande M, Gonzalez M, Helgesen AL, Alemany V, Sánchez-Piris M, Bachs O, Millar JB, and Aligue R (2005). Inactivation of the Cdc25 phosphatase by the stress-activated Srk1 kianse in fission yeast. Mol Cell, 17, 49-59). Pel que fa al paper de la Srk1 en el cicle cel·lular normal, hem descrit que actua inhibint la transició g2/M mitjançant la fosforilació inhibidora de la fosfatsa CDc25, promovent la seva unió a una proteïna 14-3-3 (Rad24 en S. pombe) i la seva posterior exclusió del nucli tal i com s'havia descrit per a la quinasa de checkpoint Chk1. Pel que fa al paper de la Srk1 en resposta a estrès, estudis paral·lels duts a terme pel grup de la Dra. Quinn van descriure que la Srk1 és fortament induïda en resposta a estrès i que sota aquestes condicions és fosforilada de manera depenent de la MAPK Sty1. Amb la finalitat de determinar la naturalesa d'aquesta fosforilació i la seva rellevància en la resposta a estrès vam realitzar una sèrie d'assajos de fosforilació in vitro que demostren que la Srk1 és fosforilada i activada en la T463 per la MAP quinasa Sty1. A més a més, hem observat que l'activitat i estabilitat de la Srk1 depèn de la presència de la MAP quinasa, ja que en absència de Sty1 la Srk1 no és activa i es degrada via proteasoma. Per altra banda, hem establert el paper de la Srk1 en resposta a estrès: és la responsable d'aturar el cicle cel·lular en la transició G2/M per tal d'evitar que les cèl·lules continuin dividint-se fins que s'hagin adaptat a l'estrès imposat. Aquesta funció la realitza a través de la fosforilació de la Cdc25, promovent la seva unió a Rad24 i exclusió del nucli. A més a més, hem descrit que la fosforilació de la Srk1 per la MAPK és necessària per a que les cèl·lules responguin correctatment a l'estrès. Finalment, experiments recents indiquen un nou paper de la Srk1 controlant negativament la via de les MAP quinases de resposta a estrès. Hem observat que en absència de Srk1, Sty1 es manté fosforilada durant períodes de temps molt més llargs, fet que suggereix un paper en el mecanisme de silenciament de la via un cop la font d'estrès ha desaparegut o la cèl·lula s'ha adaptat a ella. Els nostres resultats indiquen que la Srk1 fosforila la T225 de la MAPKK Wis1 afectant la seva unió amb la MAPK Sty1, de manera que s'afavoreix la defosforilació per les fosfatses Pyp1 i Pyp2 i s'evita una possible reactivació de la via que resultaria tòxica per a la cèl·lula.
Estudi de la resposta immune en pacients infectats pel VIH-1 sotmesos a teràpies immunomediades
(Universitat de Barcelona, 2008-11-25) López Plana, Anna; Plana Prades, Montserrat; Enrich Bastús, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] La infecció pel virus de la immunodeficiència humana (VIH) es caracteritza per un descens progressiu en la funció i el nombre de limfòcits T CD4+, amb la conseqüent aparició d'infeccions oportunistes. El tractament antiretroviral de gran activitat (TARGA) ha disminuit significativament la morbilitat i mortalitat associades a la infecció pel VIH, però tot i així no permet l'eradicació de la infecció. Aquest és el principal motiu pel qual es busquen teràpies alternatives com les teràpies immunomediades (en la present tesi han estat les interrupcions estructurades del tractament i una vacuna terapèutica de cèl·lules dendrítiques pulsades amb el virus autòleg inactivat per calor), encaminades a estimular el sistema immunològic, principalment la recuperació de la resposta específica cel·lular contra el VIH. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat els següents: (1) analitzar les conseqüències de les interupcions estructurades del tractament sobre la dinàmica de la resposta de les cèl·lules T CD4+ i T CD8+ VIH-1-específiques, sobre les subpoblacions de cèl·lules T, i sobre la resposta limfoproliferativa a antígens policlonals i de record en pacients crònics infectats pel VIH-1 amb un sitema immunològic preservat; (2) estudiar l'eficàcia d'una vacuna terapèutica de cèl·lules dendrítiques pulsades amb virus autòleg inactivat per calor en pacients crònics infectats pel VIH-1 amb un sitema immunològic preservat; (3) estudiar les característiques fenotípiques i funcionals de les cèl·lules T CD4+ i T CD8+ VIH-1-específiques en aquests pacients després del calendari d'immunitzacions amb la vacuna de cèl·lules dendrítiques; i per últim (4) analitzar els epítops immunodominants de les regions p17 i p24 del gen gag dels esmentats pacients per analitzar la influència de la variabilitat d'aquests epítops sobre la resposta immune anti-VIH-1 observada.
Caracterització d'una proteïna de 55 KDa associada a la matriu nuclear durant la proliferació cel·lular
(Universitat de Barcelona, 1991-11-20) Aligué i Alemany, Rosa Maria; Bachs Valldeneu, Oriol; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] L'estudi realitzat ha estat la identificació i caracterització de proteïnes de la matriu nuclear, concretament d'una proteïna de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferació cel.lular. La matriu nuclear és una estructura obtinguda després d'una extracció de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els últims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com són: l'organització i replicació de l'ADN, la transcripció i l'acció hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidències desvetllen la importància dels components de la matriu nuclear en la regulació de la síntesi de l'ADN i la proliferació cel.lular, com l'increment d'expressió de molts oncogens, que codifiquen proteïnes nuclears les quals s'associen a l'activació proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). També s'ha descrit l'increment de moltes altres proteïnes, incloent la calmodulina, proteïnes acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatòcits durant la fase replicativa de la regeneració (12). Totes aquestes dades suggereixen que la síntesi de certes proteïnes i la seva associació amb la matriu nuclear pot ésser un procés important per a la regulació de la replicació de l'ADN i la proliferació cel.lular en general. El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificació d'una proteïna de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la síntesi d'ADN durant la regeneració hepàtica després d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular. El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la síntesi d'ADN suggería que fos una proteïna relacionada directament amb la replicació de l'ADN. A causa de l'interès que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la síntesi d'ADN i posterior divisió cel.lular, i atès que es desconeixen les proteïnes que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracterització de la p55. Per tal propòsit s'ha purificat i s'han produït anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquímics que han desvetllat la localització nuclear d'aquesta proteïna en el teixit hepàtic regenerant. A partir de la seqüència parcial d'aminoàcids, s'ha obtingut que la p55 presenta una gran homologia amb les queratines, concretament amb la queratina núm. 8. Atès que les queratines són proteïnes de la família de filaments intermedis, descrits com constituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localització és citoplasmàtica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines. Els estudis realitzats a nivell bioquímic, en teixit hepàtic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patró de les dues proteïnes és el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.laciò in vitro i mitjançant immunotransferències emprant els anticossos esmentats anteriorment. Com a conclusió d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les dues proteïnes són la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquímics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribució citoplasmàtica i la p55 nuclear. Posteriorment, s'inicià l'estudi de la p55 en distintes línies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepàtic regenerant. S'ha utilitzat la línia cel.lular NRK 44F (cèl.lules normals no epitelials de ronyó de rata). Aquestes cèl.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'ésser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular. S'ha analitzat, mitjançant tècniques immunocitoquímiques, la presència de la p55 en aquestes cèl.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cèl.lules NRK en fase S. L'ànalisi bioquímica ens indica que el patró electroforètic bidimensional de la proteïna detectada en les cèl.lules NRK, és similar al de la p55 de les cèl.lules hepàtiques. Presenta una forma majoritària i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lació. En canvi, el pes molecular de la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55 en aquestes cèl.lules no és de 55 KOa, si no de 62 KOa. Pel que fa a la correlació que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cèl.lules hepàtiques, és interessant indicar que les cèl.lules NRK 44F no són cèl.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta típicament queratines com a components dels filaments intermedis), són fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis. S'ha comprovat, mitjançant estudis immunocitoquímics i per immunotransferència la composició dels filaments intermedis de les cèl.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que és conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un únic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de línies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals. Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cèl.lules NRK no presenten queratines, únicament presenten vimentina. També s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com són: les cèl.lules HeLa (cèl.lules d'adenocarcinoma humà), MOCK (cèl.lules epitelials de ronyó de gos), BRL (cèl.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cèl.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratolí). En totes aquestes cèl.lules, l'anticòs anti-p55 presenta localització exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferències respecte a la proteïna detectada. En les cèl.lules HeLa i MDCK l'anticòs anti-p55 detecta específicament una proteïna de 55 KOa, igual que en les cèl.lules hepàtiques. Una altra característica comú entre aquestes cèl.lules i les del fetge és que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis. En les cèl.lules 3T3 NIH, l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cèl.lules NRK. Cal destacar que ambdós tipus de cèl.lules són fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis. Així doncs podem indicar que l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de localització nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cèl.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteïna detectada per l'anticòs presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cèl.lules que no contenen queratina la proteïna detectada presenta entre 60-62 KOa. S'ha intentat esbrinar si la proteïna de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlació amb la vimentina, com és el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Però, a més de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina té un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patró electroforètic, així com tampoc s'ha observat que l'anticòs antivimentina reconegui la p55, ni l'anticòs anti-p55 la vimentina, contràriament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge. CONCLUSIONS: Com a conclusió final podem dir que la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55, encara que no presenti sempre una correlació amb el tipus de filament intermedi típic del tipus cel.lular en estudi, té relació amb els filaments intermedis degut a la seqüència d'aminoàcids que presenta. La proteïna identificada es pot considerar una proteïna estructural de la matriu nuclear implicada en la segregació dels cromosomes durant la divisió cel.lular, ja que els estudis immunocitoquímics realitzats en cèl.lules en mitosi, emprant l'anticòs anti-p55, ens mostren una reacció associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patró que el fus mitòtic. BIBLIOGRAFIA: 1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475. 2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536. 3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761. 4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046. 5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410. 6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293. 7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610. 8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380. 9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438. 10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986. Caneer. Res. 46: 3111-3117. 11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res. Commun. 150: 1162-1169. 12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154. 13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202.
Implicación de los filamentos de actina en la arquitectura, homeostasis y tráfico de salida del aparato de Golgi y estudio de la formación y degradación de un agresoma de actina
(Universitat de Barcelona, 2008-03-26) Lázaro Diégez, Francisco; Egea Guri, Gustavo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] El citoesqueleto de actina es imprescindible para el mantenimiento de la morfología celular, así como para realizar diversas funciones como la movilidad/migración y división celular. En términos generales, este componente del citoesqueleto está constituido por los filamentos de actina o microfilamentos (MFs) y por una serie de proteínas de unión y/o relacionadas con la actina, implicadas en la organización estructural de los MFs y en la regulación de la dinámica de polimerización/despolimerización de actina. Una forma sencilla y eficaz de interferir en la dinámica de actina es mediante el uso de toxinas de actina. En este trabajo se ha realizado un estudio exhaustivo de los efectos provocados por estas toxinas a nivel de la morfología celular, arquitectura y de salida de proteínas del aparato de Golgi, bien por depolimerización de los MFs (citocalasina D, latrunculina B, micalolide B o toxina botulínica C2) o bien por su polimerización aberrante o estabilización (jasplakinolide). El análisis de los efectos provocados por las distintas toxinas revela como éstos son dependientes del tipo celular, modo de acción de la toxina así como de la concentración y tiempo de exposición a esta. Hemos observado como los cambios de la morfología de las cisternas producto de la despolimerización de los MFs se correlacionan con variaciones en la homeostasis el pH de este orgánulo. Según lo cual, pensamos que los MFs participan en el diseño y mantenimiento de la forma aplanada de las cisternas del aparato de Golgi, probablemente regulando, en parte, la maquinaria molecular implicada en el mantenimiento de la homeostasis iónica de este orgánulo. Por otro lado, hemos observado como los MFs participan de forma variable en la salida del aparato de Golgi de cargo no asociado a balsas lipídicas con destino basolateral y apical. Sin embargo, son prescindibles en la salida de cargo asociado a balsas lipídicas con destino apical. Paralelamente a estos resultados que implican a los MFs en la morfo-funcionalidad del aparato de Golgi, hemos desarrollado un modelo celular para generación de agresomas de actina filamentosa, los cuales han sido descritos en distintas enfermedades como el Alzheimer o el acoholismo crónico bajo el nombre de cuerpos de Hirano. En este sentido, el jasplakinolide es capaz de inducir la formación reversible de un agresoma de actina filamentosa similar al cuerpo de Hirano cuya degradación está mediada por los sistemas proteasomal y lisosomal/autofagia. Por último, describimos por primera vez in vitro la generación y coexistencia de dos agresomas originados por mecanismos diferentes sin que tenga lugar en ningún momento la mezcla de sus componentes moleculares.
La Via JAK/STAT com a mediadora de respostes a l'estrès oxidatiu, La inflamació i la immunitat innata en astròcits
(Universitat de Barcelona, 2008-02-08) Gorina Méndez, Roser; Planas Obradors, Anna Maria; Alberch i Vié, Jordi, 1959-; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] En la isquemia cerebral se desarrolla un proceso inflamatorio que contribuye a incrementar la muerte neural. La presencia de células necróticas promueve la activación de la respuesta inmune innata que contribuye a iniciar el proceso inflamatorio. Las citoquinas actúan de mediadoras de la respuesta inmunitaria e inflamatoria. Durante la reoxigenación después de la isquemia, se generan especies reactivas de oxígeno (ERO) que aumentan el daño por reperfusión. En respuesta a la isquemia cerebral, se activan proteínas de la via de señalización JAK/STAT. Esta vía participa en la respuesta celular a los ERO y a las citoquinas. De modo que la inflamación, la respuesta inmune innata y el estrés oxidativo son los procesos derivados de la isquemia/reperfusión que potencialmente pueden activar la vía JAK/STAT. La vía JAK/STAT utiliza un mecanismo en el cual los factores de transcripción STAT que se hayan en estado latente en el citoplasma son fosforilados en tirosina por las quinasas de la familia Janus, dando lugar a la dimerización y translocación al núcleo de las STATs. Las proteínas STAT modulan la expresión de genes relacionados con la diferenciación, la inflamación y la supervivencia. El objetivo de esta tesis es el estudio de la activación de la vía JAK/STAT en respuesta al estrés oxidativo, la inflamación y la inmunidad innata en astrocitios. La vía Jak2/Stat1 se activa en respuesta a citoquinas proinflamatorias, como IFN-gamma y interleuquina-6, y peróxido de hidrógeno en astrocitos, y promueve la muerte celular a las 24 horas. El tratamiento con el inhibidor de Jak2, AG490, previene de la muerte demostrando la implicación de la vía Jak2/Stat1 en la muerte. La activación de la vía Jak2/Stat1 es específica de peróxidos, ya que tratamientos con otros agentes proxidantes, tales como el sulfato de hierro (donador de iones hidroxilo), el nitroprusiato (donador de óxido nítrico) o el paraquato (donador de aniones superóxido) inducen la generación de EROs pero no activan a Stat1. De manera que el peróxido de hidrógeno induce específicamente la activación de la vía Jak2/Stat1. Paralelamente, los tratamientos con peróxido de hidrógeno y los compuestos antioxidantes trolox y propilgallato, inhiben la generación de EROs pero no detienen la activación de Stat1, mientras que el tratamiento de peróxido de hidrógeno con el antioxidante N-acetil-cisteína no reduce la producción de EROs y si inhibe la activación de Stat1. Estos resultados demuestran que la activación de Stat1 y la generación de EROs son efectos independientes. En el siguiente trabajo se demuestra que los siRNAs (por small interfering RNAs) inducen efectos inespecíficos en determinados tipos celulares de manera dependiente de secuencia e independiente del efecto silenciador. En cultivo glial mixto, el tratamiento con siRNAs aumenta la expresión de Stat1 y de otras moléculas proinflamatorias como iNOS, la citoquina IL-6 y las quimiocinas IP-10 e IP-9. La adición de un grupo O-metilo en la cadena sense del siRNA no impide el silenciamiento de la proteína para la cual es específico, y si inhibe el incremento de la expresión de los marcadores inflamatorios que se han estudiado. La activación de la inmunidad innata se observa en cultivo de glía mixta y en cultivo puro de astrocitos, pero no tiene en cultivo de microglía pura ni en la línea celular no glial 3T3, demostrando que los astrocitos son particularmente sensibles a desarrollar respuestas inmunes innatas frente al tratamiento con siRNAs. En este trabajo se demuestra que los siRNA activan la respuesta inmune innata en astrocitos activando el receptor TLR3, puesto que el tratamiento con siRNA, del mismo modo que el tratamiento con el agonista de TLR3, poly di dC, induce un aumento de la expresión de este receptor. En esta tesis, se pone de manifiesto el papel de la vía JAK/STAT en la modulación del estrés oxidativo, la inflamación y la inmunidad innata.
El Papel del diacilglicerol en el tráfico de membranas en la zona entre el retículo endoplasmático y el complejo de Golgi
(Universitat de Barcelona, 2008-12-15) Fernández Ulibarri, Inés; Egea Guri, Gustavo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[spa] DE LA TESIS: El DAG es esencial para formar los intermediarios de transporte que se dirigen a la membrana plasmática. Sin embargo, no existen evidencias de su posible participación en las etapas tempranas de la vía secretora. Por tanto, nos centramos en averiguar la implicación del DAG en el transporte de proteínas en la zona del ER/Golgi. Para ello, utilizamos una variedad de fármacos conocidos que inhiben las enzimas responsables de la producción del DAG. Nuestros datos indican que el DAG está implicado en la formación de vesículas COPI en el compartimento temprano del Golgi, concretamente en el proceso de fisión, a través del reclutamiento de ArfGAP1. Posteriormente, estudiamos si la LPP3 (PAP2b) era una de las enzimas responsables de controlar los niveles necesarios de DAG en el cis-Golgi para la formación de las vesículas COPI y la regulación del transporte retrógrado. Para determinar el papel de la LPP3 en la regulación de los niveles de DAG y en la organización y transporte asociado a este compartimento seguimos dos estrategias experimentales: ARN de interferencia para disminuir la expresión de la LPP3 y vectores de expresión para aumentarla. Los resultados sugieren que la LPP3 regula la producción de DAG en las membranas de Golgi y, además, que participa en la organización estructural y funcional del complejo de Golgi, al menos en el transporte retrógrado. Paralelamente, estudiamos si la PKC epsilon era un efector del DAG en el Golgi implicado en la formación de las vesículas COPI. El DAG actúa como un segundo mensajero modulando la localización y la actividad enzimática de ciertas proteínas citoplasmáticas en el Golgi. Estas proteínas tienen un dominio de unión a DAG (dominio C1) que le permite su interacción directa con este lípido y así regular diferentes procesos asociados al Golgi. La PKD se recluta al TGN a través de su unión con el DAG y resulta esencial para la formación de intermediarios de transporte en el TGN. Teniendo en cuenta que la PKC epsilon interacciona con el coatómero, pensamos que podría ser un buen candidato para regular el transporte ER/Golgi de forma similar a la que PKD realiza en el TGN. Nuestros resultados muestran que la PKC epsilon se recluta en el Golgi de manera dependiente de DAG, pero no parece participar en el transporte retrógrado en la zona endoplasmático /complejo de Golgi.
L'Annexina A6 regula el transport intracel·lular de caveolina
(Universitat de Barcelona, 2008-11-28) Cubells Diez, Laia; Enrich Bastús, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] El colesterol regula la localització subcel.lular de l'Anx6, i intervé en el transport de la caveolina de Golgi fins a la membrana plasmàtica. En aquest treball hem demostrat com l'Anx6 regula el transport de caveolina produint una alteració en el transport de colesterol intracel.lular des del compartiment endocític tardà fins a l'aparell de Golgi. Es va investigar la localització de la caveolina i el tràfic d'aquesta proteïna en el nostre model cel.lular, una línia transfectada de forma estable per a la sobreexpressió d'Anx6 (CHOAnx6). Hem demostrat que nivells elevats d'Anx6 provoquen una acumulació de caveolina al complex de Golgi. Aquest increment de caveolina s'associa a una acumulació de colesterol lliure als endosomes tardans, que alhora provoca una disminució dels nivells de colesterol a la membrana plasmàtica i a les membranes de Golgi. La disminució de colesterol al Golgi impedeix que la caveolina monomèrica pugui formar oligomers que és el requisit necessari perquè pugui sortir del Golgi i arribar a la membrana plasmàtica. Per això, en les cèl.lules CHOAnx6 el nombre de caveoles a la membrana està reduït fins a un 50%. Afegint consistència a aquests fets, tant l'expressió ectòpica de la proteïna NPC1 salvatge (que transporta el colesterol cap a fora dels endosomes tardans) com l'adició de colesterol soluble exogen, reverteixen l'acumulació de caveolina , que arriba amb normalitat a la membrana, i es recupera el nombre de caveoles fins a nivells control. En ambdós casos, també desapareix l'acumulació de colesterol lliure als endosomes. Aquesta reversió del fenotip també es produeix inhibint totalment la funcionalitat de l'Anx6 amb l'RNA d'interferència específic per a aquesta proteïna. Tots aquests resultats en conjunt demostren que la sobreexpressió d'Anx6 produeix una acumulació de colesterol als endosomes tardans, que fa que no arribi prou colesterol al Golgi, retenint la caveolina en aquest compartiment, i inhibint la formació de caveoles a la membrana plasmàtica.
Comportament funcional heterogeni de les mutacions "missense" a l'extrem N-terminal de CFTR
(Universitat de Barcelona, 2008-11-24) González Gené, Gemma; Casals, Teresa; Aran Perramon, Josep M.; Enrich Bastús, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica
[cat] La Fibrosi Quística (FQ; MIM# 219700) és una de les malalties letals més comuns en les poblacions d'origen caucàsic, amb herència autosòmica recessiva. El seu fenotip clínic es caracteritza per l'acumulació de moc viscós en òrgans exocrins, amb conseqüències patològiques en el tracte respiratori, gastrointestinal i urogenital. Mutacions al gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ABCC7; MIM# 602421) són responsables de la malaltia. Fins al moment, ja s'han descrit més de 1600 mutacions en el gen CFTR. La gran majoria són mutacions puntuals de les quals: 42% són mutacions de sentit erroni (missense). El gen CFTR codifica per una proteïna de membrana de 1480 aminoàcids, que pertany a la gran família dels transportadors ABC. La proteïna CFTR presenta una estructura simètrica, formada per dos motius repetits, cadascun d'ells format per una regió transmembrana (TMD), composada per sis α-hèlix, i una regió citosòlica hidrofílica d'unió a ATP (NBD). Aquests dos motius queden units mitjançant un domini regulador (R), citosòlic i hidrofílic, que és fosforila per PKA i PKC. El paper principal que desenvolupa el canal CFTR en la part apical de les cèl·lules epitelials és el transport de fluid transepitelial i electròlits a través de la membrana, activitat que ve regulada directament per la fosforilació de PKA. Aquest canal permet el trànsit d'ions de clorur a través d'ell en qualsevol direcció, i es caracteritza per tenir una baixa conductància unitària (la seva conductància és de 7-10 pS). Existeixen moltes evidències en la literatura on les mutacions de sentit erroni, independentment de la seva localització en el gen CFTR, poden afectar a la funció del canal CFTR a diferents nivells: biogènesi de la proteïna, transport i localització, propietats electrofisiològiques del canal. Així que l'objectiu general de la tesi va ser l'anàlisi molecular i funcional de vuit mutacions amb sentit erroni (p.P5L, p.S50P, p.E60K, p.R75Q, p.G85E, p.G85V, p.Y89C, p.E92K) localitzades en la regió N-terminal de CFTR, i identificades majoritàriament a la població espanyola. Per portar a terme els objectius de la tesi, es van generar les vuit mutacions per mutagènesi dirigida en el vector pCMVCFTRNot6.2wt, i es van expressar en cèl·lules epitelials HEK293. Es va analitzar el processament i patró de maduració de les proteïnes mutants per Western blot i la seva localització cel·lular per immunocitoquímica. I posteriorment, es van caracteritzar funcionalment els canals mutants mitjançant la tècnica de Patch clamp en configuració whole cell i excised inside-out. Vam observar que cinc de les mutacions analitzades, p.S50P, p.E60K, p.G85E, p.G85V i p.E92K, provoquen un processament i una maduració incorrecte de la proteïna. Totes cinc presenten un comportament molt similar a la mutació p.F508del, podent-se classificar aquestes mutacions dins la classe II. La mutació p.P5L afecta a la funció de CFTR a dos nivells: a nivell de la biogènesi i a nivell de l'activitat del canal. Aquesta mutació provoca una disminució de la densitat de canals a la membrana citoplasmàtica. La conductància i la cinètica del canal també s'alteren. La proteïna mutant p.Y89C afecta a l'activitat del canal. Aquesta mutació altera específicament la cinètica del canal. El canal CFTR corresponent a la mutació p.R75Q presenta un patró de maduració i un comportament funcional del canal anàleg a la proteïna CFTR no mutada. Els nostres estudis corroboren la classificació de p.R75Q com a mutació sense expressió clínica. El comportament sever de la majoria de les mutacions avaluades, afectant la biogènesi i/o l'activitat del canal, ressalta la importància funcional de la cua N-terminal i del segment TM1 en la fisiologia de CFTR.

El Dipòsit Digital ha actualitzat el programari. Contacteu amb dipositdigital@ub.edu per informar de qualsevol incidència.

Examinar

Enviaments recents