Carregant...
Fitxers
Tipus de document
TesiVersió
Versió publicadaData de publicació
Si us plau utilitzeu sempre aquest identificador per citar o enllaçar aquest document: https://hdl.handle.net/2445/36331
Biosíntesi d’isoprenoides en bacteris i plantes. Aproximacions biotecnològiques
Títol de la revista
Autors
Director/Tutor
ISSN de la revista
Títol del volum
Resum
[cat] Els isoprenoides constitueixen una vasta família de compostos naturals que duen a terme una amplia varietat de funcions, moltes d’elles essencials, en els tres dominis de la vida. No obstant tots ells deriven d’una única molècula comú, el IPP (i el seu isòmer DMAPP) que es produeix a través de dues possibles rutes biosintètiques, la via del MEP i la via del MVA. La via MEP és la predominant en eubacteris mentre que la del MVA ho és en arqueobacteris, fongs i animals. En plantes coexisteixen les dues vies de forma compartimentalitzada. Aquesta distribució diferencial de les dues vies ha convertit la via MEP en una nova i prometedora diana per al disseny de nous antibiòtics (amb la FSM, un inhibidor específic de l’enzim DXR de la via MEP com a màxim exponent), molt necessaris en l’actualitat com a conseqüència de l’emergent resistència que han desenvolupat un gran nombre de microorganismes patògens a les drogues desenvolupades fins al moment. No obstant, tot i que el caràcter essencial dels isoprenoides fa que la seva síntesi es mantingui en tots els éssers vius la enorme plasticitat gènica, que es concentra especialment en bacteris, ha donat lloc a l’adopció d’estratègies alternatives tant a nivell d’enzims com metabòlits. Els carotenoides conformen una subfamília dintre dels isoprenoides de compostos derivats de la molècula parental de 40 carbonis, el fitoe, amb funcions que comprenen tant el metabolisme primari com el secundari. Es sintetitzen principalment en els plastidis de les plantes però també són produïts per alguns bacteris no fotosintètics i fongs. La seva creixent aplicació en la indústria ha fet molt atractiva l’aplicació de la biotecnologia per a la producció d’aquests compostos però per poder afrontar amb garanties aquest repte cal conèixer a fons els mecanismes que regulen a tots nivells la seva producció.
Al llarg d’aquest treball s’ha combinat l’estudi dels aspectes bàsics i aplicats de la síntesi d’isoprenoides amb especial èmfasi en el paper de la via del MEP i la biosíntesi de carotenoides per proposar i avaluar estratègies de millora de la seva producció tant en bacteris com en plantes. El treball ha permès testar l’us d’enzims bifuncionals per millorar simultaniàment dos passos catalítics de la ruta carotenogènica tant en sistemes bacterians com en plantes. Es va analitzar l’efecte de la fusió de LCYE i LCYB (ε-ciclasa i β-ciclasa respectivament) en expressar-la en un sistema model carotenogènic de E.coli o en plantes transgèniques d’Arabidopsis thaliana obtenint-se resultats positius en el primer cas però no en el segon. Aquesta diferència posa de manifest la major complexitat dels sistemes vegetals. En aquesta línia es va explorar el possible paper addicional de la regulació post-transcripcional en el control del flux de la via del MEP utilitzant un mutant (rif18) obtingut en base a un escrutini de resistència a la inhibició per FSM. L’estudi va posar de manifest un nivell de regulació com a resultat de la integració i coordinació de la ruta MEP amb la resta del metabolisme de la planta especialment els metabolismes del sucre i de les hormones.
Paral.lelament es va avaluar el paper que juguen individualment cada un dels enzims de la via MEP en el control del flux de la via en sistemes bacterians. L’estudi de la sobreexpressió de cada un dels gens en un sistema model carotenogènic de E.coli va posar de manifest el paper clau de DXS i la participació en menor mesura de DXR i HDR, resultats similars als descrits en Arabidopsis. Però, encara més important, va demostrar que uns nivells moderats de sobrexpressió dels enzims clau produeixen millors resultats en l’acumulació de productes finals. Complementariàment es va estudiar en profunditat el paper de HDS tant en bacteris com en plantes ja que havia estat descrit préviament com un possible punt de regulació diferencial entre els dos sistemes en base a les diferències observades en alineaments de seqüència. En cap dels dos casos un increment de l’activitat d’aquest enzim millorava l’acumulació de productes finals.
Els dos passos identificats com a claus en la ruta MEP (DXS i DXR) es van escollir com a objectius sobre els que, aprofitant la plasticitat gènica i metabòlica dels bacteris, cercar noves activitats alternatives. Per DXS es van identificar dues proteïnes de E.coli (E1-PDH i DHBPS) que en patir mutacions puntuals adquirien la capacitat de complementar la deficiència de DXS. Per identificar activitats alternatives a DXR es va analitzar la presència d’homòlegs pels 7 gens de la via MEP en els genomes seqüenciats de microorganismes. Es va identificar un grup en els que hi eren presents tots ells excepte DXR. Utilitzant el genoma de Brucella abortus es va identificar una proteïna sense homologia amb DXR (DRL) capaç de suplir-ne l’absència i que defineix una nova família de proteïnes la funció de les quals era desconeguda. La seva caracterització va mostrar que catalitza la mateixa reacció amb propietats cinètiques similars a les descrites per DXR però amb diferències significatives, com una menor eficiència catalítica o una menor sensibilitat a la inhibició per FSM. L’estudi filogènetic de la família va posar de manifest l’existència de DRL vertaderes (amb activitat DXR) que s’agrupaven en un mateix clade filogenètic i DRL falses definint a l’hora tres classes de proteïnes. La cristal.lització i resolució de l’estructura tridimensional de la proteïna DRL de Brucella abortus va permetre un estudi estructural comparatiu observant-se diferències significatives respecte DXR especialment en el reordenament del centre actiu. A partir d’aquestes diferències es va hipotetitzar, en base a modelitzacions in silico, la possibilitat d’inhibir diferencialment els dos enzims. Aquesta possibilitat es va confirmar en estudis d’inhibició in vitro amb les proteïnes DXR de E.coli, i DRL de B.abortus recombinants purificades. Els α-fenil derivats de la FSM mostraven una capacitat d’inhibició de DXR en l’ordre nanomolar mentre que no mostraven cap efecte sobre DRL a concentracions de fins a 1 mM obrint la porta al disseny de nous antibiòtics de gran especificitat.
Descripció
Matèries
Matèries (anglès)
Citació
Citació
PEREZ GIL, Jordi. Biosíntesi d’isoprenoides en bacteris i plantes. Aproximacions biotecnològiques. [consulta: 10 de desembre de 2025]. [Disponible a: https://hdl.handle.net/2445/36331]