Tesis Doctorals - Departament - Ciències Fisiològiques II

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36614

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 48

Model experimental de toxicitat còcleo-vestibular per administració intratimpànica de cisplatí en la rata
(Universitat de Barcelona, 2018-03-15) Callejo Castillo, Àngela; Llorens i Baucells, Jordi; Doménech Juan, Ivan; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] Els estudis in vivo són necessaris per a estudiar l´ototoxicitat i avaluar possibles tractaments otoprotectors. La rata i el ratolí són dues de les espècies més utilizades per estudis pre-clínics de toxicologia i farmacologia, però l´administració sistèmica de cisplatí causa un índex de morbilitat molt alt en aquestes espècies. Es va establir la hipòtesi que l´administració intratimpànica de cisplatí aportarà un model adeqüat per a l´estudi de la toxicitat tant coclear com vestibular en la rata. Sota aquesta premisa, es va administrar cisplatí a rates mascles de la soca Long Evans per via intratimpànica, en una orella a diferents dosis (50µl, 0,5 a 2mg/ml) segons el grup, mentre que la orella contralateral, injectada amb sèrum fisiològic, servia de control. La toxicitat coclear es va demostrar mitjançant l´estudi histològic, mentre que la toxicitat vestibular es va demostrar mitjançant l´estudi funcional comportamental. En cap dels experiments es va registrar episodis de letalitat i l´únic signe de morbilitat registrat va ser una lleu pèrdua de pes corporal. El cisplatí va causar un toxicitat coclear dosi-dependent, demostrat mitjançant el recompte de cèl·lules ciliades a les espires apical i mitja de les còclees, i la toxicitat vestibular mitjançant l´anàlisi comportamental. Podem concloure que l´administració intratimpànica de cisplatí és un model fàcil, reproduïble i segur per a l´estudi de la toxicitat còcleo-vestibular en la rata. Considerem que aquesta ruta d´exposició pot ser útil per a avaluar qüestions específiques sobre la ototoxicitat induïda per cisplatí i per a estudiar possibles tractaments otoportectors.
Role of TGFβ family members on physiological angiogenesis and ovarian cancer
(Universitat de Barcelona, 2016-01-21) Alsina Sanchís, Elisenda; Viñals Canals, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[eng] Role of TGFβ in physiological angiogenesis and ovarian cancer Transforming Growth Factor Beta (TGFβ) is a signalling pathway involved in a wide range of cellular processes such as proliferation, differentiation, angiogenesis, migration and homeostasis. In addition, it has been broadly related with pathological situations like cancer or other diseases. In this thesis we have been focused on two of its receptors; the TβRI called ALK5, ubiquitously expressed, and ALK1, an endothelial cell-restricted receptor. In the first part of this work we have studied the role of ALK1 in angiogenesis. Loss of function mutations in ALK1 cause a subtype of hereditary haemorrhagic telangiectasias (HHTs) characterized by vasculature malformations. Currently, there is no suitable treatment to cure these patients. To study the ALK1 role in vascular development, we have used the retina mouse model and seeking to find a treatment for these patients, we have used a mouse model for HHTs. This mouse model has a heterozygous alteration in ALK1, as in homozygosis die at +/- mice resulted in abnormal endothelial cell proliferation mid-gestion. The alteration on ALK1 and increased retinal vessel width without affecting pericyte coverage, migration or elongation of the ECs. We have shown that genetic and pharmacological inhibition of PI3K signalling +/- abolished the increase in vessel width in ALK1 retinas and normalized vasculature. Overall, our results suggest the potential for using PI3K inhibitors as new therapeutic agents for treating HHTs. In the second part of this work we have searched for new therapeutic targets for treating epithelial ovarian cancer. Firstly, we analysed the TGFβ signalling pathway in these tumours. Using a Tissue Micro Array (TMA) with patient samples we found high Smad2 phosphorylation, a read-out of ALK5 activation, in epithelial ovarian cancer tumoral cells, independently of tumour subtype (high-grade serous or endometrioid). To evaluate the impact of TGFβ receptor inhibition on tumoral growth, we used different models of human epithelial ovarian cancer orthotopically grown in nude mice (OVAs); two high-grade serous carcinoma and one endometrioid carcinoma. We have confirmed that the histological properties and the levels of phosphoSmad2 expression pattern were maintained on the ovarian tumour mouse models compared to its human primary tumours samples. Treatment with a TGFβRI&II dual inhibitor, LY2109761, caused a significant reduction in tumour size in all these models, affecting cell proliferation rate. On the contrary, TGFβ inhibition did not affect ovarian tumour cell capacity to disseminate in our models. We identified Insulin Growth Factor (IGF)1 receptor as the signal positively regulated by TGFβ implicated in ovarian tumour cell proliferation. We have demonstrated that our TMA samples had high IGF1R protein levels and that phosphoSmad2 and IGF1R protein levels significantly positively correlated. Inhibition of IGF1R activity by treatment with a blocker antibody (IMC- A12) or with a tyrosine kinase inhibitor (linsitinib) inhibited ovarian tumoral growth in vivo. At the molecular level TGFβ signalling positively controls IGF1R levels by two mechanisms. Induction of mRNA IGF1R levels in some cell lines or tumour samples, whereas a change on IGF1R protein localization was observed in others. In fact, TGFβ inhibition decreased IGF1R protein levels by controlling its stability; increasing IGF1R internalization and degradation through the lysosome. When IGF1R levels were decreased by shRNA treatment, ovarian cancer cell lines grew less and LY2109761 lost its capacity to block tumoral ovarian cell proliferation. Overall, our results suggest an important role for the TGFβ signalling pathway in ovarian tumour cell growth through the control of IGF1R signalling pathway. Moreover, it identifies anti-TGFβ inhibitors as being of potential use in new therapies for ovarian cancer patients as an alternative to IGF1R inhibition, being used in clinical trials.
Molecular mechanisms regulating osteoblast differentiation: miR-322/Tob2 and PI3K/SMAD networks
(Universitat de Barcelona, 2015-12-17) Gamez Molina, Beatriz; Ventura Pujol, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[eng] The present work describes molecular mechanisms controlling osteoblast differentiation. The thesis has been divided in two main objectives: 1. miR-322/Tob2 regulatory circuit is a new molecular mechanism controlling Osterix mRNA degradation and fine-tuning osteoblast differentiation program We propose a molecular description of the mechanism whereby the osteogenic master gene Osx is controlled post-transcriptionally through a mechanism driven by miR¬322/Tob2, strongly suggesting that control of specific mRNA decay is relevant in bone development and homeostasis. miR-322 has been previously studied together with miR¬503 in myogenesis as promoters of cell cycle quiescence and differentiation by down-regulation of Cdc25A. Our results also show that, after differentiation by BM P-2, the miR¬322 level progressively decreases in C2C12 and MC3T3-E1 cells and primary cultures of BM¬MSCs. We have mentioned the up-regulated expression of osteogenic transcription factors during BMP-2 treatment. Then, miR-322, by means of Tob2 down-regulation, adjusts the expression levels of some of these factors, particularly Osx. This profile seems to allow the transcriptional up-regulation of the osteogenic transcription factors, whereas miR-322 may later exert a regulatory mechanism that allows fine-tuning of bone homeostasis. Tobi and Tob2 proteins constitute a Tob subfamily and belong to the BTG/Tob antiproliferative factor protein family. Tob genes have emerged as key players in mediating post-transcriptional gene expression by regulating mRNA deadenylation and therefore cytoplasmic mRNA levels. Our results suggest that new target genes displaying compatible Tob-interacting secondary structures at their 3'-UTR could be subjected to specific mRNA repression by Tob family members, as we suggest here for Osx. These data are in agreement with previous research showing that, although Tobi knock-out mice are born without apparent phenotypic abnormalities, Tobi-deficient adult mice were shown to have higher bone mass compared with wild-type mice. It has been shown that Tob proteins can interact with CPEB2-4 and specifically intensify the rapid decay of particular transcripts. Their RNA-binding domains recognize mRNAs with specific secondary structures containing U-rich loops and interact with single-stranded uridines as well as double-stranded stems present in the 3'-UTR of the target mRNA. Recent studies showed Tobi interaction with cytoplasmic CPEB2-4, which negatively regulate the expression of a target by tethering to specific mRNA and mediating recruitment of the deadenylase Cnot7, leading to specific mRNA decay. The Osx 3'-UTR contains secondary structures with a stem-loop structure similar to those bound by CPEB2-4. Our RNA pulldown analysis showed that these sequences are directly bound by CPEB proteins and Tob2. Thus, in view of our results, we hypothesize that Osx mRNA could be bound by Tob2 and CPEB2-4 and, as a consequence, specifically degraded. Future work is necessary to discern which CPEB-like proteins are involved in the interaction between Tob2 and stem-loop structures in the 3'-UTR of Osx and other osteogenic genes. 2. Class I PI-3-Kinase signaling is critical for bone formation through regulation of SMADi activity in osteoblasts The present work reveals that PI3Ka and (3 isoforms are major regulators of osteoblast differentiation and survival. Deletion of either p110alpha and/or piio6 impairs osteoblast differentiation by decreasing the expression of key osteoblast-determining transcription factors and their transcriptional targets. More importantly, these results establish a network of molecular events that integrate distinct osteogenic inputs such as IGFi, Wnts and BMPs. Signals from these cytokines converge on GSK3 inhibition and higher SMADi levels, which confers a larger response to the osteogenic BMP action on osteoblasts. Our results confirm that p110alpha is critical for early bone formation and development and further demonstrate this requirement for postnatal bone homeostasis. Deletion of p110alpha during early bone development causes an osteopenic phenotype in bones of both endochondral and intramembranous origin. We also took advantage of an inducible Cre system to delete p110alpha at 1-2 days of age, when bone architecture is already established and BMD and cortical thickness were approximately 4o-5o% of that of adult mice. Postnatal p110alpha deletion also led to a significant loss of either calvarial, cortical or trabecular bone at 12 weeks of age. When p110alpha was deleted, although a slow proliferation rate and higher sensitivity to apoptosis was seen in cultured osteoblasts in vitro, there were no significant changes in the total number and proliferation rate of osteoblasts in bones of prim-deficient mice. These data mirror those previously obtained in Pten-deficient mice. Moreover, deletion of p1106 did not increase sensitivity to apoptosis in osteoblasts, but it also produced a strong bone phenotype. In our mouse model, lack of PI3K isoforms leads to similar changes in the expression of osteoblast-specific transcription factors in calvaria, long bone and osteoblast cultures. Whereas Runx2 expression was significantly reduced only after deletion of both p110alpha and piio6, Osx expression was strongly suppressed in all cases. OSX has been shown to transcriptionally regulate the expression of Cohal, Ibsp, Bglap and Fmod. Thus, lower levels of OSX could account for impaired osteoblast maturation and function, through decreased transcription of these genes.. GSK3 is a multifunctional kinase that is constitutively active and negatively regulated by numerous signaling pathways such as PI3K/AKT and canonical Wnt. Evidence suggests a negative role for GSK3 activity in osteogenesis. Our data identified GSK3 activity as a novel node of integration for multiple osteogenic signals. Previous studies have shown that MAPK and GSK3 pathways can interfere with BMP signaling. SMADi is sequentially phosphorylated on its linker region by MAPKs and GSK3. The latter modification primes for the recognition and polyubiquitination of SMAD1 by the SMURF1 and -2 E3 ubiquitin ligases. Thus, GSK3-regulated cellular levels of SMAD1 integrate signals from PI3K activators and Wnts with those of the BMPs to give a coordinated osteogenic readout. Our results conclude that genetic or pharmacological inhibition of PI3K blocks the inhibitory phosphorylation of GSK3 and regulates SMAD1 protein stability. These effects on SMADi levels were partially reversed by pharmacological inhibition of GSK3. The effects on osteoblast-specific gene expression could be reversed by ectopic expression of exogenous SMAD1. Further cooperation comes from the fact that GSK3 activity also governs nuclear levels of (3-catenin. Moreover, SMAD1 and 13-catenin transcriptionally cooperate in key osteogenic gene promoters. Thus, the present findings represent a molecular framework to understand the mounting evidence showing cooperative activation of osteoblast differentiation and function by IGFs, Wnts and BMPs.
Molecular mechanisms of apoptosis induction by AICAR and the new prohibitin-binding compound fluorizoline
(Universitat de Barcelona, 2015-07-23) Moncunill Massaguer, Cristina; Gil i Santano, Joan; Iglesias i Serret, Daniel; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[eng] The pro-apoptotic effects of two new drugs have been studied for the development of new strategies for cancer treatment. On the one hand, we proved that AICAR induces apoptosis in an AMPK- and p53-independent manner in mouse embryonic fibroblasts. The analysis of the BCL-2 family members allowed the identification of the BH3-only proteins BIM and NOXA as required for apoptosis induction by AICAR. In addition, we characterized the mechanism of action of fluorizoline (compound 1a), a new drug that specifically binds to prohibitin 1 and 2. The presence of prohibitins was proved to be essential for the pro-apoptotic effects of fluorizoline. Prohibitins mediate the increases in BIM and NOXA, two proteins that play a key role in the onset of apoptosis by fluorizoline.
Assessing metabolic plasticity in diet-induced obese mice upon lifestyle intervention. An integrative approach
(Universitat de Barcelona, 2015-12-18) González Franquesa, Alba; García-Roves, Pablo M. (Pablo Miguel); Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[eng] Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is the metabolic disorder that accounts for the presence of hyperglycemia within insulin resistance (IR). The International Diabetes Federation estimated in 2013 that 382 million people (8.3% of world society ) had diabetes and that this number is set to rise beyond 592 million people in the next 22 years. T2DM accounts for 90% of people with diabetes (WHO 1999). Obesity is considered a major risk factor for developing T2DM over time. The World Health Organization (WHO) stated in 2014 that more than 1.9 billion adults were overweight and of these, over 600 million were obese (body mass index (BMI) > 30 kg/m2). Besides healthcare costs, WHO projects that diabetes will be the 7th leading cause of death in 2030 (Mathers & Loncar 2006). Once T2DM is diagnosed, the first therapeutic approach is by lifestyle counselling consisting of an increase in physical activity and changes in the patient dietary habits. The aim of this project is to study and integrate the metabolic responses that regulate systemic glucose homeostasis. We are not aware of other works describing in a holistic way the different metabolic processes regulating glucose homeostasis in different tissues that play an important role during the development and onset of diet-induced T2DM. With this approach, we will gain more insight and a better knowledge of the metabolic alterations taking place during an obese state induced by high-fat diet, as well as assess the degree of reversibility that can be reached by undergoing a lifestyle intervention, known as “metabolic plasticity”. For this purpose a diet-induced obese animal model of T2DM is used. To achieve the presented aims, a phenotypical and funcional study is performed at systemic level in order to complete a more experimental and detailed approach afterwards in each of the studied tissues: pancreas, white adipose tissue, liver, oxidative and glycolytic skeletal muscle, and hypothalamus. This experimental approach encompasses tissue-specific-functional analysis, gene expression studies, protein content determination and signalling, metabolomics and RNAseq. Likewise, systems biology tools have been developed and have allowed to measure several correlations as well as perform different types of multivariant analysis with the studied parameters. Three experimental groups are defined representing the metabolic stages of interest: control group (Ctrl); pathologic group (HFD, that mimic diet-induced T2DM after 16 wks on HFD; and in which animals showed overweight, and fasting hyperglycemia and hyperinsulinemia); and a third group (Int) that follows a lifestyle intervention consisting of caloric restriction, modification of the fatty acid source and carbohydrates in the diet, and the performance of an exercise training programme. The diet-induced obese experimental group (HFD group) reported the typical physiological features of the pathological state: overweight, fasting hyperglycemia, hyperinsulinemia and hyperleptinemia, increase in fat mass and volume, increase of white adipose tissue, liver and pancreas weight, increase of liver and oxidative skeletal muscle triglycerice levels, glucose intolerance, insulin resistance, increase in beta-cell mass along with hypertrophic enlarged islets and dysfunction in glucose-stimulated insulin secretion in vivo and in vitro, and a diminishment in oxygen consumption, heat production and scapular temperature. Lifestyle intervention was enough to revert most of the disruptions reported in the pathological group. However, certain irreversibility degree was still observed in particular studied parameters: (1) alteration in fasting glucose and glucose-stimulated insulin secretion in vivo, (2) increment in pancreatic beta-cell area, (3) affectation in the epididymal white adipose tissue with inflammation and immune cell infiltration, as well as (4) mitochondria dysfunction, already observed in the pathological state. Taken all this together, we can conclude that the pathological state left a certain degree of metabolic irreversibility does not allow a total recovery of the phenotype across the different tissues studied, at least with this type of intervention and timings. The development and application of systems biology tools have allowed the study the irreversibility degree in an integrative mode, the correlations among certain parameters at a multiorganic level, the gene expression patterns of complexes described from a protein-protein interaction (PPI) network. These strategies and computational approaches have led to the identification of most of the altered tissues and metabòlic pathways in the different states under study.
Repercusiones sobre la presión arterial y las células progenitoras CD34+ tras diferentes tipos de entrenamiento
(Universitat de Barcelona, 2015-06-25) Niño Mendez, Oscar Adolfo; Viscor Carrasco, Ginés; Javierre Garcés, Casimiro F.
[spa] En la actualidad existe una gran evidencia científica sobre los múltiples beneficios que ofrecen la actividad física y el ejercicio físico en la promoción y mantenimiento de la salud. Los diferentes estudios han mostrado un abanico de resultados favorables en todas las poblaciones estudiadas. El correcto funcionamiento del endotelio vascular es de vital importancia en la salud cardiovascular y la incorporación de programas de ejercicio físico pueden representar un medio eficaz en la atención primaria y secundaria de la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares. Las células madre hematopoyéticas CD34+, se originan fundamentalmente en la médula ósea y son trasportadas en la sangre periférica, a su vez, contribuyen a la hematopoyesis y pueden ser activadas mediante la actividad física contribuyendo en la formación de nuevos vasos sanguíneos y en la regeneración en los casos de existir lesión. Por otro lado, las diferentes investigaciones no son muy claras sobre los efectos de los diferentes programas de ejercicio físico (aeróbico, fuerza y mixto) en las concentraciones de sangre periférica de células madre CD 34+, tampoco sobre los tiempos de mayor concentración sanguínea pos-esfuerzo. Así mismo, existe poca información sobre los efectos sobre la presión arterial en reposo, en ejercicio submáximo y ejercicio máximo, después de los diferentes programas de ejercicio físico mencionados anteriormente. El objetivo principal ha sido examinar los efectos fisiológicos producidos en el organismo después de realizar diversas actividades y/o programas de ejercicio físico específico (aeróbico, de fuerza o mixto). En conclusión, la realización de una única actividad física aeróbica de muy larga duración produce aumentos en la concentración sanguínea de células madre hematopoyéticas CD34+ circulantes a los 5 días post-esfuerzo. La realización de 3 diferentes programas de ejercicio físico de 6 semanas de duración (aeróbico, fuerza o mixto) no produjo cambios significativos en la concentración sanguínea de células madre hematopoyéticas CD34+. Dado que se detectó una relación inversa entre los cambios observados en la concentración sanguínea de las células madre hematopoyéticas CD34+ y los valores de las mismas al inicio del estudio, deberán tenerse en cuenta los valores basales y su variabilidad siempre que se deban evaluar los cambios observados tras un estímulo de cualquier naturaleza. La realización de un programa de ejercicio físico aeróbico de 6 semanas de duración aumenta la potencia máxima y el VO2máx con respecto a los valores obtenidos inicialmente. La ejecución de un programa de entrenamiento mixto de 6 semanas produce mayor disminución de la presión arterial en reposo que el obtenido solo con ejercicio aeróbico o de fuerza. La presión arterial durante un ejercicio submáximo y máximo disminuye tras un programa de 6 semanas de duración ya sea de tipo aeróbico, de fuerza o mixto, manteniéndose el descenso de dichos valores tras 3 semanas de desentrenamiento.
Paper del canal de clorur CIC-2 en les patologies de la mielina
(Universitat de Barcelona, 2015-04-17) Arnedo Llena, Tanit; Estévez Povedano, Raúl; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel·lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. Recentment s’ha descrit mutacions en ClC-2 associades a un tipus de leucodistròfia vacuolitzant. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna GlialCAM i ClC-2 i així aprofundir en el coneixement de en el seu paper en les cèl·lules glials així com en la fisiopatologia de les leucoencefalopaties vacuolitzants. Per a realizar aquest objectiu es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la caracterització bioquímica i funcional de noves mutacions en GLIALCAM associades a MLC. S’ha obtingut una classificació de les mutacions en GLIALCAM en funció del defecte que presentaven. S’ha descrit mutacions defectives en la expressió proteica, defectives en la homooligomerització i en el tràfic a les unions cel·lulars, defectives únicament en el tràfic cel·lular, mutacions sensibles a la manca de MLC1 i mutacions defectives en la internalització de la proteïna. Paral·lelament es va aprofundir en la relació bioquímica entre GlialCAM i ClC-2 a partir de l’estudi bioquímic i funcional de mutacions en CLCN2 associades a leucoencefalopaties vacuolitzants. S’ha observat que GlialCAM augmenta la funció del canal ClC-2 a través de la modificació del gating del canal i de la estabilització de ClC-2 a la membrana plasmàtica però no sembla que millori la sortida de ClC-2 del reticle endoplasmàtic. A més, aquesta estabilització requereix de la formació d’homocomplexes de GlialCAM. Per últim, es va generar i caracteritzar un model knock-down de la proteïna ClC-2 per aprofundir el paper de ClC-2 en els astròcits. Així com també es va avançar en la relació bioquímica i funcional entre GlialCAM i ClC-2 en la fisiologia astrocitària. S’ha descrit que en astròcits en cultiu en condicions d’alta concentració de K+, similar al que succeiria en situacions d’alta activitat neuronal, ClC-2 es transloca de l’aparell de Golgi a les membranes cel·lulars, modificant les seves propietats funcionals per l’efecte de GlialCAM. En canvi, en astròcits deficients de MLC1, ClC-2 es troba retinguda citoplasmàticament. Aquest fet, indicaria que aquestes proteïnes podrien tenir un paper en el procés de sifoneig del K+, i per tant, la deslocalització de ClC-2 podria donar lloc a un desordre en l’homeòstasi d’aigua i ions.
Estudi d’un Model d’Exposició Subcrònica a IDPN en la Rata: Patologia Vestibular i Reparació
(Universitat de Barcelona, 2015-03-20) Sedó Cabezón, Lara; Llorens i Baucells, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] La pèrdua de funció del sistema vestibular causa vertigen, pèrdua d’equilibri i pèrdua de mirada fixa durant el moviment, sovint acompanyats de marejos i nàusees. Els trastorns de l’equilibri són comuns a les persones grans i alteren el seu patró de marxa, sent un important factor de risc per a les caigudes. En els éssers humans, una de les causes de pèrdua de funció vestibular és la toxicitat d’alguns fàrmacs, com antibiòtics aminoglicòsids, medicaments antipalúdics, diürètics de nansa, agents quimioterapèutics com el cisplatí, així com una sèrie de productes químics d’exposició laboral. La diana principal de la toxicitat són les cèl·lules ciliades. Estudis d’exposició aguda en animals han demostrat clarament que els components ototòxics poden causar discapacitat permanent perquè causen la degeneració de moltes o totes les cèl·lules ciliades. Aquestes cèl·lules no poden regenerar o ho poden fer de manera limitada en algunes espècies de mamífers com el conill d’Índies i la xinxilla i en qualsevol cas la recuperació funcional és limitada o nul·la. En peixos, amfibis i ocells les cèl·lules ciliades es produeixen i es poden regenerar al llarg de tota la vida. Les noves cèl·lules ciliades procedeixen de les cèl·lules de suport seguides de dos possibles mecanismes: mitosis o transdiferenciació. Aquestes evidències d’estudis experimentals no serveixen per explicar la recuperació funcional que té lloc en els humans després de la interrupció de l’exposició crònica ototòxica. Quan en pacients a qui s’ha diagnosticat ototoxicitat es para el tractament, els resultats són molt variables: des de la persistència completa dels símptomes fins una recuperació incompleta o completa. Encara que la recuperació comportamental es pot explicar en part per fenòmens de compensació al sistema nerviós central, es coneix molt poc sobre els mecanismes cel·lulars i moleculars involucrats en el dany vestibular crònic i la seva possible recuperació, així como la seva rellevància a nivell comportamental. Per a estudiar els processos involucrats en el dany i reparació vestibulars associats amb la ototoxicitat crònica i la subsegüent recuperació, es van exposar rates Long Evans mascles a IDPN (3,3’-iminodipropionitrilo) via l’agua de beguda durant vàries setmanes i es van avaluar al final del període d’exposició i al final d’un període de recuperació. Per a identificar les etapes de dany que són susceptibles de reparació i que poden ser la base de la recuperació funcional, es van examinar les característiques ultraestructurals de les crestes i els utricles. La intoxicació crònica per IDPN provoca pèrdua de les cèl·lules ciliades per extrusió. Per a revelar més característiques ultraestructurals del dany ototòxic i la seva posterior recuperació, així com dels efectes ciliars, es van examinar les crestes per microscòpia electrònica de transmissió. Per a caracteritzar la dinàmica del dany aferent i del procés de reparació, es van estudiar mitjançant immunohistoquímica i microscòpia de fluorescència confocal l’expressió de proteïnes prèviament identificades en el contacte entre el calze aferent i la cèl·lula ciliada de tipus I. El següent pas va ser estudiar que passava amb les cintes de les sinapsis aferents de les cèl·lules ciliades de tipus I i de tipus II. El model d’ototoxicitat crònica induït per IDPN a l’aigua de beguda, causa retracció i fragmentació del calze aferent abans que tingui lloc la mort de les cèl·lules ciliades per extrusió. En aquest treball es presenten les evidències que el desmantellament de les unions septades és un procés anterior al dany aferent durant la ototoxicitat crònica i que l’extensa reparació de les unions septades i del calze aferent són possibles després d’aturar-se l’agressió.
Estudio observacional de variables clínicas de pacientes operados de cirugía cardiaca y evaluación de su influencia sobre el pronóstico vital
(Universitat de Barcelona, 2014-11-19) López Delgado, Juan Carlos; Javierre Garcés, Casimiro F.; Ventura i Farré, Josep Lluís; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa] Las variables clínicas en pacientes sometidos a cirugía cardíaca(CCA) se asocian con el pronóstico a corto y largo plazo en términos de mortalidad y morbilidad. Se han estudiado variables postoperatorias, aunque también variables pre- e intraoperatorias habituales, realizándose 5 líneas de investigación: paciente cirrótico, Acute Kidney Injury(AKI), cociente Presión parcial de oxígeno arterial/ Fracción inspirada de oxígeno (PaO2/FIO2), niveles de lactato arterial(LA), y el Índice de Masa Corporal(IMC). En el paciente cirrótico sometido a CCA la presión venosa central inicial es un factor independiente asociado a mortalidad hospitalaria, mientras que un SAPS III elevado y el volumen de orina menor en las primeras 24h fueron predictores de mortalidad a largo plazo. El MELD score(sensibilidad(S):85.7%;especificidad(E):83.7%) y el SAPS III(S:83.3%;E:64.9%)tienen el mejor poder predictivo a corto y a largo plazo respectivamente en esta población. La supervivencia global en toda la muestra(n=59) fue peor según el grado de hepatopatía (82.4% para Child A, 47.6% para Child B y 33.3% para Child C;P=0.001). Las características asociados a la fisiopatología del paciente cirrótico deben tenerse en especial consideración a la hora de someter estos pacientes a CCA. El desarrollo de AKI en el período postoperatorio tuvo una incidencia del 14%. Identificamos un mayor tiempo de circulación extracorpórea(CEC), una mayor necesidad de drogas vasoactivas y un mayor LA a las 24h tras ingresar en UCI como predictores de AKI. Una peor supervivencia se asoció a un mayor grado de AKI según la escala RIFLE modificada:74.9% para el subgrupo Risk,42.9% para el Injury, y 22.3% para el Failure(P<0.001) (seguimiento medio de 6.9±4.3años), siendo estos dos últimos asociados de manera independiente a una mayor mortalidad. El desarrollo de estrategias para la prevención de los factores de riesgo es básico para mejorar no tan sólo la incidencia de AKI, sino los resultados de la CCA en general. El cociente PaO2/FIO2 puede ser útil para la identificación de pacientes de CCA con mal pronóstico en el postoperatorio inmediato. Valores más bajos a las 3h tras el ingreso en UCI son los más útiles en términos de predicción de mortalidad. Asimismo hay una mayor mortalidad intra-UCI y complicaciones respiratorias con PaO2/FIO2<241 a las 3h. También se asoció a una peor supervivencia intrahospitalaria en comparación con PaO2/FIO2>241 a las 3h (88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% IC:1.293–1.786;P=0.004). El LA elevado(>3.0mmol•L-1)es frecuente en el postoperatorio de CCA y su elevación se asocia a mal pronóstico. La presencia de un LA>3.0mmol•L-1 fue un predictor para mortalidad hospitalaria(OR:1.468; 95% IC:1.239–1.739;P<0.001) y para la mortalidad a largo plazo(HR:1.511;95% IC:1.251–1.825;P<0.001). El antecedente de un infarto de miocardio(IAM) reciente y sufrir un mayor tiempo de CEC fueron predictores de un LA. El patrón dinámico del LA fue similar en supervivientes y no supervivientes pero con mayores valores en no supervivientes(ANOVA de medidas repetidas, P<0.001). Asimismo, el área bajo la curva objetivó mayores niveles de LA en los no supervivientes(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). Nuestros resultados objetivan una dinámica parecida de la curva de LA entre supervivientes y no supervivientes con mayores valores en estos últimos, lo cual podría sugerir un mecanismo similar del LA pero con una mayor producción en los no supervivientes. Aquellos pacientes que presentaron un LA>3.0mmol•L-1 y su pico se objetivó a las 24h tuvieron peor supervivencia(79.1%vs.86.7–89.2%;P=0.03)comparados con aquellos que presentaron su pico al ingreso, a las 6h o a las 12h durante el postoperatorio. La obesidad influencia de manera notable la estratificación y planificación de la CCA. Algunos estudios han objetivado mejores resultados en la población obesa en comparación con la población con IMC normal respecto a la mortalidad y supervivencia. Tras ajustar las variables preoperatorias e intraoperatorias mediante propensity score, una peor oxigenación y mejor estado nutricional, reflejados por una peor PaO2/FiO2 y unos niveles más elevados de albúmina, fue observado en pacientes con IMC elevado. Los pacientes obesos mostraron mayor riesgo para IAM peroperatorio(OR:1.768;95% CI:1.035-3.022;P=0.037)y sepsis(OR:1.489;95% CI:1.282-1.997;P=0.005). No hubo diferencias en la mortalidad hospitalaria entre grupos, aunque los pacientes con sobrepeso mostraron una mejor supervivencia al año comparados con la población normal(91.2%vs.87.6%;P=0.029). A pesar de ello, nuestros resultados no apoyan el concepto obesity paradox, que puede ser el resultado de sesgos en los diferentes estudios publicados. La mejoría del estudio pronóstico de variables en el postoperatorio inmediato las convierte en herramientas a pie de cama que ayudan al clínico en la toma de decisiones e influyen en la supervivencia de sus pacientes. Sin lugar a dudas, una mejor precisión pronóstica conlleva una mejoría en establecer el grado de vigilancia y cuidados que requiere cada paciente, y en consecuencia, los recursos destinados. La mayor precisión en el pronóstico a largo plazo tiene obvias e importantes ventajas, tanto desde el punto de vista clínico del paciente a nivel individual como desde el punto de vista sanitario y social.
Bases moleculars de la Leucoeocefalopatia Megalencefàllca amb Quists subcorlicals. Utilització de models animals i cel·lulars
(Universitat de Barcelona, 2014-09-19) Sirisi Dolcet, Sònia; Estévez Povedano, Raúl; Nunes Martínez, Virginia; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals, també anomenada MLC, és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel•lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. En la present tesi s’han generat i estudiat diferents models animals i cel•lulars per a l’estudi de la malaltia. En primer lloc, s’ha generat i s’ha caracteritzat un model de ratolí knock-out per a Mlc1. Gràcies a aquest model s’ha observat que la proteïna MLC1 és únicament astrocitària i que la proteïna GlialCAM no es independent de MLC1, ja que en absència d’aquesta es troba deslocalitzada en el cerebel. També s’ha pogut descriure per primer cop la implicació del canal de Cl- ClC-2 en la fisiopatologia, ja que els seus nivells de proteïna disminuixen en el cerebel i el canal es troba gairebé inactiu en els oligodendròcits de l’animal knock-out. Les característiques fenotípiques que presenta el model de ratolí equivalen a les característiques observades en els pacients en fases inicials de la malaltia, ja que l’animal tot i que mostra presència de vacuoles no presenta deteriorament motor i macrocefàlia aparent. També s’ha generat un model de peix zebra knock-out per a zmlc1. Aquest model presenta avantatges respecte el ratolí, com per exemple el baix cost o l’aplicació de tècniques genètiques a gran escala. Aquest model ha permés observar de nou que realment GlialCAM necessita a MLC1 per a la seva correcta localització. També s’ha observat que l’ortòleg zGlialCAMa conserva la seva funció de entre espécies ja que també es capaç de modificar les corrents de ClC-2. Aquests resultats obtinguts amb els models s’han pogut comparar amb el cervell d’una pacient. Aquest cervell demostra que MLC1 és necessària per a la correcta localització de GlialCAM en la regió del cerebel. Per altra banda, s’han desenvolupat diferents models cel•lulars. Primerament s’han estudiat els astròcits del ratolí knock-out. Aquestes cel•lules mancades de MLC1 també presenten vacuoles per tot el citoplasma, però no mostren canvis en la localització ni en els nivells de proteïna de GlialCAM i ClC-2. Aquest fet juntament amb altres estudis del grup van fer pensar si la condició necessària per a que es veguessin afectades aquestes proteïnes estaria relacionada amb el procés del sifoneig de K+. Estudis realitzats en astròcits de rata demostren que en condicions d’un alt contingut de K+, com per exemple durant una alta activitat neuronal, GlialCAM i ClC-2 és localitzen juntament a les membranes cel•lular i ClC-2 canvia les seves propietat de canal. Paral•lelament, estudis realitzats en oligodendròcits de rata també demostren que aquest fet també succeix en aquest tipus cel•lular.
Caracterización funcional de la interacción de la proteïna p53 con la ubiquitina ligasa HERC2º
(Universitat de Barcelona, 2014-07-21) Cubillos Rojas, Mónica; Rosa López, José Luis; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa] Este trabajo identifica a HERC2 como una proteína que se une a p53 y modula su actividad transcripcional mediante la regulación de su oligomerización. En una primera etapa, implementamos un sistema de geles en gradiente Tris-acetato que permitió el análisis de proteínas gigantes como HERC2 y otras de menor tamaño (hasta de 10 kDa) en un solo gel de electroforesis. Después, estudiamos el papel de HERC2 en la regulación de p53, mapeando los dominios involucrados en la interacción, evaluando los niveles de expresión, actividad transcripcional, localización subcelular y oligomerización de p53 en ausencia de HERC2, para demostrar finalmente que la expresión ectópica del dominio CPH de HERC2 es suficiente para promover la oligomerización de p53 y aumentar su actividad. También se demostró que una mutación patológica de HERC2, que origina un cambio de aminoácido en la posición 594 causa la inestabilidad de la proteína, reduciendo casi por completo su expresión. Esta mutación causa una enfermedad con un fenotipo muy similar al síndrome de Angelman. Con los fibroblastos de individuos afectados por la mutación en HERC2, realizamos ensayos para estudiar la actividad transcripcional de p53 encontrándola reducida. Finalmente, demostramos que los ratones knockout para Herc2 son letales en homocigosis, demostrando que Herc2 es un gen esencial en el desarrollo embrionario de los ratones.
Tumores germinales testiculares: mecanismos de adquisición de resistencia al cisplatino y desarrollo de una aproximación terapéutica para el tratamiento de tumores refractarios
(Universitat de Barcelona, 2013-11-08) Muñoz Almendros, Clara; Villanueva Garatachea, Alberto; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa] Los tumores germinales testiculares (TCGT) son una neoplasia poco frecuente, ya que sólo representa alrededor del 2% de los cánceres que afectan al varón. Sin embargo, son el tumor más frecuente en hombres caucásicos de entre 15 y 40 años, siendo la principal causa de muerte en este rango de edad. Aunque un elevado porcentaje de estos tumores (alrededor del 80%) presentan una alta sensibilidad a la quimioterapia basada en cisplatino (CDDP), incluso en casos de enfermedad diseminada, aún existe un porcentaje no menospreciable de pacientes que no lograrán una respuesta completa duradera debido al desarrollo de recidivas resistentes a la quimioterapia y que acabarán falleciendo a causa de la enfermedad. Por este motivo, el estudio y la comprensión de los mecanismos mediante los cuales los tumores consiguen evadir los efectos citotóxicos del CDDP es de vital importancia para mejorar la efectividad de las terapias actuales, así como para definir nuevas estrategias de tratamiento. Partiendo de esta base, el presente trabajo se ha centrado en dos objetivos principales: a) el estudio de las mutaciones y cambios genéticos relevantes en el proceso de adquisición de resistencia al CDDP en estos tumores, y b) desarrollo y evaluación de la eficacia de una nueva terapia combinada basada en CDDP y un inhibidor de poli (ADP-ribosa) polimerasas, olaparib, para tratar tumores testiculares refractarios a la quimioterapia convencional. Para abordar el primer objetivo, se realizó un estudio mutacional de la línea celular de cáncer testicular SuSa mediante secuenciación de última generación (NGS). Utilizando esta técnica, se compararon las mutaciones presentes en el genoma de la línea celular original sensible al fármaco y su derivada resistente. Una vez seleccionadas las mutaciones potencialmente implicadas en el proceso de adquisición de resistencia, se evaluó la relevancia de los genes candidatos mediante un screen con siRNAs. Esta técnica también nos permitió estudiar la implicación de otros genes que, aún no presentando mutaciones en su secuencia, pudiesen estar relacionados con la resistencia debido a otros tipos de desregulaciones funcionales. Paralelamente, gracias a la generación en nuestro grupo de un modelo murino de xenoinjertos ortotópicos de cáncer testicular, se pudo conseguir mimetizar in vivo el fenómeno de adquisición de resistencia a CDDP, tratando tumores sensibles de origen humano implantados en los testículos de ratones con concentraciones crecientes de fármaco, hasta obtener tumores resistentes. Esto nos permitió la realización de otro experimento de NGS para comparar el exoma de tumores primarios humanos sensibles y sus derivados resistentes al CDDP, con el objetivo de estudiar los cambios producidos in vivo en el proceso de adquisición de resistencia utilizando un modelo más cercano a la clínica. En cuanto al segundo objetivo, partiendo de la base de que los TCGTs son tumores cuya sensibilidad se caracteriza por niveles reducidos de mecanismos de reparación de lesiones en el DNA, y que durante el proceso de adquisición de resistencia parece ser que estos tumores son capaces de incrementar esta capacidad de reparación, pensamos que sería muy interesante utilizar un fármaco cuya actividad estuviera dirigida a inhibir la reparación en el DNA. Así, evitando una reparación eficiente, podríamos potenciar el efecto citotóxico producido por las lesiones en el DNA causadas por el CDDP. De esta manera, se estudió el efecto del olaparib sólo o en combinación con el CDDP sobre diferentes líneas celulares de TCGT, tanto a nivel molecular como in vitro, y, posteriormente, in vivo en ratones xenoinjertados con tumores que habían demostrado su resistencia en la clínica, obteniendo unos resultados altamente prometedores.
Teràpia dirigida a receptors ErbBs i teràpia antiangiogènica en tumors germinals testiculars
(Universitat de Barcelona, 2013-05-24) Juliachs Milà, Mercè; Viñals Canals, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] En aquesta tesi s’ha realitzat l’avaluació de l’eficàcia de la teràpia antiangiogènica i la teràpia dirigida a receptors ErbBs en tumors germinals testiculars (TGTs). Tot i que els TGTs són dels tumors amb taxes de curació més elevades, la incidència de la malaltia va augmentant en les poblacions caucàsiques i encara hi ha pacients que presenten resistència al cisplatí, amb l’agreujant de que són pacients joves entre 15 a 35 anys. En primer lloc hem observat que els receptors ErbB1, ErbB2 i ErbB3 s’expressen de manera generalitzada en els TGTs ortotòpics de diferent component histològic, mantenint a més a més el patró d’expressió del tumor primari a xenògraft. En un d’aquest models, el coriocarcinoma TGT38, es va avaluar l’eficàcia de les teràpies dirigides contra els receptors ErbBs. En estudis previs s’havia observat que aquest tumor no responia a les teràpies dirigides a ErbB1, malgrat presentava uns elevats nivells d’expressió del receptor. En aquest estudi, per contra, hem observat que el tractament dirigit de manera dual al bloqueig d’ErbB1 i d’ErbB2, tractant amb lapatinib, comprometia en un 50% el creixement tumoral, així com provocava la inhibició de les vies de senyalització efectores ERK1/2, AKT i STAT3. Demostrem doncs que l’activitat d’ErbB2 dimeritza amb ErbB3, i aquest heterodímer té un paper clau en el creixement tumoral del TGT38, així com en la proliferació de cel•lular de tumor testicular in vitro, i que confereix la resistència de novo a les teràpies dirigides a ErbB1. L’altra teràpia estudiada en aquesta tesi és l’antiangiogènica, que hem avaluat utilitzant pazopanib, inhibidor dels receptors de VEGF, dels receptors de PDGFalfai -beta,i c-KIT. Hem observat com aquest fàrmac bloqueja significativament el creixement tumoral del tumor sensible a cisplatí TGT38, així com una activitat antitumoral sinèrgica amb lapatinib. Per altra banda també hem observat un bloqueig significatiu en el TGT44, un model tumoral que presenta resistència a cisplatí, característica mantinguda del tumor primari on ja va presentar refractorietat al quimioterapèutic. En ambdós models tumorals hem observat que pazopanib tenia una activitat antiangiogènica i antitumoral, així com també hem observat com bloquejava la proliferació de cèl•lules tumorals de TGTs in vitro presentant més efecte en les cèl•lules amb resistència a cisplatí que en les sensibles. En aquesta línia d’investigació hem observat com PDGFRbeta, un dels receptors diana de pazopanib, es sobre expressa en els fenotips resistents de parelles sensibles-resistents a cisplatí, tant de línies cel•lulars de TGTs com de tumors ortotòpics testiculars. Hem demostrat també que el principal efector d’aquest receptor és AKT, observant també una sobre activació d’aquest en les cèl•lules resistents a cisplatí comparat amb les sensibles; així com una activació en presència de PDGF-BB i una disminució en presència de shRNAs pel receptor o del tractament amb pazopanib. En aquest estudi hem descrit doncs l’activació de la via de PDGF-BB/ PDGFRbeta/AKT com a nou mecanisme de resistència adquirida a cisplatí. A més a més hem observat una elevada expressió de PDGFRbetaen la majoria de TGTs humans analitzats. El conjunt dels resultats presenten a pazopanib com a possible agent per una teràpia alternativa al tractament dels pacients de TGT sensibles o resistents a cisplatí, sol o en combinació amb teràpies dirigides a receptors ErbBs.
Utilitat de la dinamometria en la rehabilitació de patologia musculoesquelètica en pacients laborals
(Universitat de Barcelona, 2013-07-02) Chaler Vilaseca, Joaquim; Javierre Garcés, Casimiro F.; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] Antecedents del tema: La mesura de la força muscular es molt útil en la rehabilitació. Tant per planificar-la com per monitoritzar-la. Igualment es una eina fonamental en l’avaluació del dany corporal o seqüeles. La dinamometria isocinètica és una eina fiable de mesura de la força muscular dinàmica. No obstant per la seva validesa s’ha de garantir que el subjecte avaluat faci un esforç màxim. En certes poblacions (com ara els pacients laborals) avaluar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova esdevé crucial per les possibles implicacions mèdico-legals. En diferents articulacions i accions i, en concret, pel que fa a rotadors externs d'espatlla s'ha trobat que la diferència entre les ràtios excèntric-concèntric a velocitat alta i baixa (DEC) és un bon paràmetre per identificar esforços submàxims en una població de voluntaris sans. No obstant això, no es tenen dades sobre la seva utilitat en pacients laborals reals. Hipòtesi: El DEC és un paràmetre vàlid per estimar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs a una població de pacients laborals reals. Objectius: Analitzar el comportament, i eventual utilitat, del DEC en una mostra de pacients reals afectats de patologia de l'espatlla i avaluats mitjançant dinamometria isocinètica al final del procés de rehabilitació. Metodologia: Estudi observacional de 74 pacients laborals amb patologia musculoesquelètica d'espatlla avaluats mitjançant dinamometria isocinètica de rotadors externs al costat afecte i contralateral. La prova es realitza a 30º/s i 120º/s a modalitat concèntrica i excèntrica .Es recullen dades demogràfiques (edat, sexe i pes), clíniques (diagnòstic, durada del procés i situació funcional a l'alta) i dinamomètriques (Pic de moment de força, Ràtios excèntrics concèntrics, DEC i dèficits comparant extremitat afecta i sana). Les dades s'analitzen per separat per a dones i homes i en relació al resultat del DEC. Resultats: Utilitzant el nivell de tall de DEC marcat per l'estudi previ en subjectes sans (0.81) la proporció de pacients etiquetats de no col•laboradors, especialment dones, era enorme. Per tant es va decidir usar els valors de l'extremitat sana per avaluar l'afectació. Aplicant aquest criteri, cinquanta-dos pacients van mostrar el costat afecte uns valors de DEC dins dels rangs considerats com normals i, per tant, es van etiquetar de col• laboradors. Deu tenien uns DEC superiors al límit superior i es van considerar no col•laboradors. Finalment hi havia 12 pacients amb uns valors de DEC extremadament baixos que es van considerar com no col•laboradors. La comparació entre sexes va mostrar una gran diferència significativa proporció de col•laboradors a favor dels homes . En els col•laboradors els dèficits registrats dels pacients sense incapacitat al final del procés mostraven uns valors molt significativament més baixos que els pacients que van acabar en incapacitat. Conclusions: El DEC pot ser una bona eina pel mesurament del nivell de col•laboració -i per tant per assegurar la validesa- durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs d'espatlla en pacients laborals. No obstant això, es necessiten més estudis en dones i poblacions no laborals per definir millor la seva utilitat. La validesa de la dinamometria isocinètica, i implícitament la del DEC, en poblacions laborals es indicada per relació significativa entre els dèficits de força analitzats i el nivell d’incapacitat.
Estudis bioquímics i funcionals de les proteïnes implicades en la Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals
(Universitat de Barcelona, 2013-09-09) Capdevila Nortes, Xavier; Estévez Povedano, Raúl; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat]La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. L’any 2001 es va identificar el primer gen responsable de la malaltia en humans denominat MLC1, tot i que existien pacients de MLC que no presentaven mutacions en MLC1 ni lligació amb el seu locus. Això suggeria que hi havia com a mínim un altre gen involucrat en la malaltia. MLC1 codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom que s’expressa en cèl•lules glials. La funció de MLC1 és desconeguda però estudis bioquímics van mostrar que mutacions en aquesta proteïna provoquen una reducció dels nivells de proteïna a la membrana i una forta retenció al reticle endoplasmàtic. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna MLC1 i així aprofundir en el coneixement de la fisiopatologia de la malaltia. Per realitzar aquest objectiu es va seguir l’aproximació experimental d’identificar i analitzar l’interactoma de MLC1. Per poder validar interaccions entre proteïnes de membrana es va utilitzar el mètode PCA de Split-TEV. Es va observar que el mètode no presentava suficient especificitat i per això, es van realitzar una sèrie de modificacions en la tècnica per obtenir una nova variant de la metodologia amb alta sensibilitat i especificitat. Paral•lelament, es van realitzar estudis de genòmica i proteòmica que van permetre obtenir un llistat de proteïnes candidates a interaccionar amb MLC1. Es van seleccionar les proteïnes més interessants i es va validar la interacció amb MLC1 per coimmunolocalització en cultius primaris d’astròcits de rata i pel mètode de Split-TEV. Mitjançant col•laboracions del grup es va realitzar un estudi genètic dels candidats favorables a interaccionar amb MLC1 i així es va identificar a GlialCAM com a segon gen implicat en MLC. GlialCAM és una proteïna amb una estructura similar a les proteïnes d’adhesió que s’expressa en cèl•lules glials. Estudis del grup van descriure a GlialCAM com a subunitat β de MLC1 i subunitat auxiliar del canal de clorur ClC-2, ja que és capaç d’interaccionar i dirigir aquestes proteïnes a les zones de contacte entre cèl•lules i provocar canvis funcional en el canal. El descobriment de GlialCAM va fer focalitzar els objectius de la Tesi en l’estudi d’aquesta proteïna. Es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la utilització de proteïnes quimèriques i la generació de delecions. Aquests estudis van identificar el domini extracel•lular de GlialCAM com a domini responsable de la interacció en cis i en trans de la proteïna. El domini citoplasmàtic es va relacionar amb la localització de la proteïna a les unions cel•lulars i finalment, es van identificar els primers aminoàcids del domini transmembrana de GlialCAM com els responsables dels canvis funcionals de ClC-2. També es van generar i caracteritzar els models knock-down tant de MLC1 com de GlialCAM en cultius primaris d’astròcits de rata. L’estudi d’aquests models i de complementacions dels models amb l’expressió de proteïnes humanes o diferents mutacions de MLC1 i GlialCAM, van permetre descriure GlialCAM com a xaperona necessària per la sortida del reticle endoplasmàtic i la localització de MLC1 a les unions astrocitàries. Estudis funcionals van permetre relacionar MLC1 amb l’activitat VRAC i el control del volum cel•lular i es va identificar com a proteïna responsable de l’aparició de vacuoles astrocitàries en els pacients de MLC. Finalment, es va observar que les mutacions en MLC1 eren capaces d’activar VRAC per se i causaven el defecte en trobar-se retingudes. La coexpressió de GlialCAM amb aquestes mutacions de MLC1 provocava una recuperació de la localització de MLC1 i una disminució del fenotip vacuolitzant astrocitari. Aquest resultat podria ser el principi d’una possible teràpia pels pacients amb MLC basada en l’augment de l’expressió en superfície de les variants mutants de MLC1.
Functional Role of Glycogen synthase Kinase-3β on Glucocorticoid-mediated signaling
(Universitat de Barcelona, 2012-10-31) Rubio Patiño, Camila; Pons i Irazazábal, Gabriel; Iglesias i Serret, Daniel; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa]Los glucocorticoides (GC) inducen la parada del ciclo celular y la apoptosis en diferentes tipos de células y por lo tanto se utilizan ampliamente para tratar una gran variedad de enfermedades incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer. Este efecto es mediado por el receptor de GC (GR), un factor de transcripción activado por ligando que transloca al núcleo donde modula la transcripción de genes diana de una manera específica de promotor. La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) regula la respuesta del GR por medio de mecanismos genómicas y no genómicas, aunque la función específica de cada isoforma no está bien definida. En este estudio se utilizaron inhibidores farmacológicos de la GSK3 y siRNAs específicos de cada isoforma para evaluar el papel de la GSK3 en la regulación génica inducida por los GC. La inhibición de la GSK3 resultó en la reducción de la expresión de ARNm inducida por GC de genes tales como BIM, HIAP1, y GILZ. El silenciamiento de la GSK3β pero no de la GSK3α redujo la inducción endógena de GILZ en respuesta a la dexametasona y la actividad luciferasa dependiente del GR. Curiosamente, la inhibición de la GSK3 no afectó la transrepresión inducida por GC. Los experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina revelaron que la inhibición de la GSK3 afecta la unión mediada por la dexametasona del GR y la ARN polimerasa II en el promotor endógeno de GILZ a través de un mecanismo que afecta la localización de la proteína del GR por medio de la disminución sus niveles nucleares. Estos resultados indican que la GSK3 es importante para la actividad de transactivadora del GR y que la inhibición de la GSK3 suprime la expresión génica estimulada por los GC. Además, se demuestra que la regulación genómica del GR por la GSK3 ocurre a través de un mecanismo que no implica los sitios conocidos de fosforilación por la GSK3. Por lo tanto, proponemos que la activación transcripcional dependiente de GC requiere una señalización funcional de la GSK3ß y que la alteración de la actividad de la GSK3β influye en la respuesta celular a los GC.
Estudi de variants de significat desconegut en la síndrome de Lynch
(Universitat de Barcelona, 2013-02-19) Borràs Flores, Ester; Capellá, G. (Gabriel); Pineda Riu, Marta; Nunes Martínez, Virginia; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] La síndrome de Lynch és la síndrome hereditària de predisposició al càncer colorectal més freqüent, i està causada per mutacions germinals en els gens reparadors MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2. L'anàlisi mutacional dels gens reparadors és moltes vegades no informatiu, degut a la detecció de variants de significat desconegut (VSD). Aquestes variants representen fins a un 30% de les alteracions detectades i és especialment complicat predir el seu efecte funcional, ja que podran interferir en el correcte processament del mRNA o en la funció de la proteïna. La identificació de VSD suposa una limitació important per a la correcta avaluació del risc de predisposició al càncer. L'objectiu d'aquesta tesi és avaluar l'impacte funcional de les VSD detectades en els gens MLH1 i PMS2 en pacients amb sospita de síndrome de Lynch. Per això hem fet estudis a nivell de splicing del mRNA, d'expressió de mRNA i proteïna, així com assaigs funcionals de reparació i estudis de localització subcel•lular. Els resultats aquí recollits permeten classificar un 81,2% de totes les VSD analitzades, el 56% s'han classificat com patogèniques i el 25% com probablement neutrals. Cal destacar, que dues de les VSD analitzades i que es van detectar amb una elevada prevalença en la nostra població, han estat caracteritzades com les primeres mutacions fundadors en el gen MLH1 identificades a Espanya, presentant una penetrància moderada. També proposem un algoritme d'estudi de variants que permeti integrar i prioritzar les diferents tècniques fins a la caracterització funcional. La classificació d'aquestes VSD ens ha permès millorar l'assessorament genètic d'aquestes famílies, permetent l'estudi predictiu de familiars de risc, així com la personalització de mesures de prevenció i seguiment apropiats.
Caracterización de la muerte celular inducida mediante la inhibición del metabolismo de la glucosa
(Universitat de Barcelona, 2012-09-25) Ramírez Peinado, Silvia; Muñoz Pinedo, Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa] Las células tumorales presentan alteraciones metabólicas. Una de las diferencias con las células no transformadas es que los tumores usan más glucosa incluso en condiciones de normoxia, lo que se utiliza actualmente para visualizar tumores mediante la técnica de PET. Ultimamente se están desarrollando terapias basadas en estas particularidades metabólicas de las células tumorales, que las hacen más sensibles a inhibición del metabolismo glicolítico. Aquí estudiamos la muerte producida por la falta de glucosa en sarcomas y otros tipos tumorales. La privación de glucosa induce apoptosis o necrosis dependiendo de la línea celular. Mostramos cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes de Bax/Bak, mientras que en las líneas de rabdomiosarcoma induce necrosis. Además la caspasa-8 está implicada en la muerte por ausencia de glucosa en estas células deficientes en Bax/Bak y también en células humanas HeLa. Investigamos el uso de 2-deoxiglucosa como inductor de muerte celular frente a líneas de rabdomiosarcoma alveolar y embrional. La 2-deoxiglucosa promueve muerte celular en líneas de rabdomiosarcoma alveolar. También induce diferenciación acompañada por una bajada de PAX3/FOXO1a, una proteína surgida de la translocación cromosómica en las células de rabdomiosarcoma alveolar y crítica en el desarrollo oncogénico de las mismas. Caracterizamos la muerte celular apoptótica inducida por 2-deoxiglucosa en líneas de sarcoma, in vitro. Estudiamos las moléculas de las rutas de apoptosis que determinan la sensibilidad de estas células a la 2-deoxiglucosa, con especial interés en las proteínas de la familia del oncogén Bcl-2. La muerte celular inducida por el tratamiento está asociada a la activación de Bax y Bak. Observamos que la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como Bcl-xL y de Mcl-1 previene la apoptosis, indicando que la muerte sucede a través de la ruta mitocondrial. Enseñamos que la bajada de Mcl-1 y la subida de Noxa son críticos en la muerte por 2-DG. Además, la 2-DG promueve estrés reticular acompañado de la inducción de ATF4 y chaperonas. Al bajar los niveles de ATF4, protegemos a las células de la muerte inducida por 2-DG y prevenimos la pérdida de Mcl-1. Incubamos células en presencia de manosa, que revierte el estrés inducido por la 2-DG y previnimos la muerte sin subir los niveles de ATP. Así, el estrés energético causado por la 2-DG no es la principal causa de muerte celular. También la 2-DG promueve la fosforilación de eIF2α, un inductor de ATF4, y la inactivación de mTOR. Nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores glicolíticos como la 2-DG pueden ser efectivos en el tratamiento de los rabdomiosarcoma alveolares y que Noxa podría ser un marcador pronóstico de la eficiencia de estas drogas. Por otro lado, caracterizamos las respuestas a la falta de glucosa y 2-DG, en particular la respuesta autofágica que puede determinar que las células mueran o no en respuesta a la falta de nutrientes. Observamos que las células están sensibilizadas al tratamiento con 2-DG tras el uso de cloroquina. Sin embargo, la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. Intentamos clarificar si la falta de glucosa está induciendo macroautofagia. El flujo de LC3 por western blot nos indica que no hay más macroautofagia ni en células DKO ni en las Rh4 en ausencia de glucosa. Por microscopía confocal y analizando células HeLa y Rh4, tampoco vemos mayores acúmulos de GFP-LC3 tras la retirada de glucosa comparando con tratamientos clásicos de inducción de autofagía como la retirada de aminoácidos o con rapamicina. Estos datos sugieren que la combinación de 2-DG con inhibidores de la autofagia podría ser útil en el tratamiento contra rabdomiosarcomas y que la falta de glucosa no induce autofagia.
Anàlisi de la resposta als tractaments combinats amb cisplatí en el càncer d'ovari: Factors implicats en la quimioresistència
(Universitat de Barcelona, 2012-11-23) Mir Cantos, Roser; Giménez Bonafé, Pepita; Tortosa i Moreno, Avelina; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[cat] El càncer d’ovari (CaOV) és el quart càncer ginecològic més comú després del càncer de mama, endometri i cèrvix i representa la cinquena causa de mort per càncer en la població femenina. El CaOV epitelial (EOC) representa el 90% de tots els tumors ovàrics i és el més letal, amb una mort anual mundial de 115.000 dones, aproximadament. La majoria de les pacients amb CaOV es diagnostiquen quan la malaltia està molt avançada. El tractament es basa en citorreducció quirúrgica seguit de quimioteràpia basada en platí i taxans, però la majoria de les pacients presenten recurrència i acaben morint a conseqüència de la metàstasi. El cisplatí (CDDP) és l’agent citotòxic utilitzat en la teràpia del CaOV, però genera quimioresistència, l’obstacle més gran per tractar les pacients amb la malaltia recurrent. Les proteïnes de resistència MDR (Multidrug resistant proteins), els processos de reparació NER o Mismatch Repair i les alteracions de la via de p53, són exemples de mecanismes que poden adquirir les cèl•lules tumorals resistents al CDDP. L'objectiu del present estudi ha estat comprendre els mecanismes de quimioresistència al CDDP del CaOV humà. L'estudi s’ha centrat en la combinació de nous fàrmacs amb el CDDP per sensibilitzar les cèl•lules resistents al CDDP. Es van establir cultius primaris de CaOV com a model ex vivo per analitzar la resposta als nous tractaments, amb origen tant de tumors sòlids com de líquid ascitic (LASC). La majoria de mostres processades van ser viables, van créixer amb èxit i es van poder congelar per l’ús experimental. El CDDP és un fàrmac genotòxic que dirigeix a les cèl•lules cap a apoptosi a través de l'activació de la via de p53. Una senyalització defectuosa en aquesta via, compromet la funció de p53, i com a conseqüència el CDDP no indueix apoptosi. Un nou grup de molècules petites no genotòxiques, les Nutlines (Nut3a) han estat desenvolupades per inhibir la unió de p53-Mdm2, induint apoptosi en tumors quimiorresistents a través de l’activació de la via de p53. En el present estudi, Nut3a es va usar per sensibilitzar la línia cel•lular resistent A2780cis al CDDP. Els resultats van mostrar que Nut3a actuava de forma sinèrgica amb el CDDP, induint aturada a la fase G2/M del cicle cel•lular i potenciant la mort cel•lular per apoptosi de la línia resistent A2780cis. A més, la combinació de CDDP+Nut3a també va induir apoptosi i senescència als cultius primaris amb p53 salvatge. Com a conclusió, la Nut3a sensibilitzava a les cèl•lules de CaOV quimiorresistents al CDDP, augmentant l’apoptosi a les línies cel•lulars i als cultius primaris de CaOV. Juntament amb la inducción d’apoptosi es va trobar una disminució del gen Survivina. Survivina, membre de la família de proteïnes anti-apoptòtiques (IAP) es troba altament expressada en tots tipus de tumors i absent en teixits adults diferenciats normals, i és responsable de la progressió del càncer i resistència a fàrmacs en molts tipus de càncer. L’YM155, és un petit compost que inhibeix selectivament l'expressió del promotor de la Survivina induint apoptosi a cèl•lules tumorals in vitro i in vivo. Estudis suggereixen que l’YM155 també és un agent que genera dany al DNA. En el present treball, es va determinar l’eficàcia de l’YM155 en combinació amb el CDDP in vitro i in vivo. Els resultats van mostrar que l’YM155 combinat amb el CDDP va intuir aturada en G2/M del cicle cel•lular, apoptosi i augment del dany al DNA a la línia A2780cis, sensibilitzant les cèl•lules al CDDP. De la mateixa manera, la combinació de l’YM155 amb el CDDP va sensibilitzar als cultius primaris de CaOV al CDDP induint també apoptosi i senescència. Treballs in vivo mostren com la combinació de CDDP i YM155 va disminuir significativament la mida tumoral dels xenoinjerts de CaOV, i va ser ben tolerat pels ratolins. Els nostres resultats suggereixen que les combinacions de Nut3a i/o YM155 amb el CDDP podrien ser una bona opció per la teràpia de CaOV resistent al CDDP, éssent la combinació amb la Nut3a exclusiva pels tumors amb p53 salvatge, i amb l’YM155 independent de l’estat de p53.
Aproximaciones bioquímicas y celulares a la fisiopatología de la Leucoencefalopatía Megalencefálica
(Universitat de Barcelona, 2012-03-16) López Hernández, Tania; Estévez Povedano, Raúl; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques II
[spa] La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC.

Examinar

Enviaments recents